超高灵敏流检测仪的多方位改进及其在化学生物学研究中的应用.pdf

摘要 摘要 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种对单个细胞或细胞大小的颗粒 ．．：‘ 一 进行快速定量分析和分选的先进技术。然而，传统的流式细胞仪难以检测粒径小 于0．5微米或者亮度少于几百个荧光素分子的颗粒。自然界中存在着众多的生物 纳米颗粒，如细菌、病毒、线粒体、分子组装体、生物大分子等，它们的尺寸均 在纳米至亚微米范围。此外，随着纳米技术的飞速发展，纳米颗粒(如纳米金、 量子点、磁性纳米颗粒、纳米乳胶微球等)被广泛地应用于标记、运载、治疗、 传感、分离以及纯化等生物技术领域。纳米颗粒以及纳米生物的单个分析可揭示 因集权平均而被掩盖的个体差异，获得颗粒的性状分布图，考察个体对于整体的 贡献。因此，发展先进的单个纳米颗粒分析技术，快速、灵敏地对纳米颗粒的尺 寸、浓度及生化特性等进行同时表征，对于化学生物学研究具有重要意义。本论 flow 文以本人硕士阶段搭建的单荧光通道超高灵敏流式检测仪(Highsensitivity 不同检测体系。 本论文主要包括以下几个方面的内容： 第一章为文献综述。主要介绍流式细胞术的概念、历史、新型流式细胞技术 的发展以及在微生物学中的应用。在本章最后部分介绍本论文的选题思路以及研 究内容。 第二章为HSFCM应用于单个纳米颗粒的检测。将单荧光通道HSFCM改进 为侧向散射光和橙色荧光信号同时检测的双通道HSFCM：采用532nln激光器 作为光源且功率控制在0．75mW，侧向散射光和橙色荧光信号分别由光电倍增管 藻红蛋白荧光信号的检测，信噪比约为17。散射光通道可以明确地检出直径为 nlil的单个聚苯乙烯纳米球，且对不同大小的聚苯乙烯纳米粒子具有优良的 100 分辨率。使用双通道HSFCM对210IIITI荧光纳米颗粒进行无标样的绝对计数， 定量检测得到的浓度与厂家的报告浓度具有良好的相关性(R20．99)，而且在 所测浓度范围内(1．62x105--3．93x107 particles／mL)检测效率达90％。对含有不 摘要 同比例的荧光纳米颗粒和非荧光纳米颗粒的混合物进行检测，取得了与理论值非 nlTI 常一致的结果。此外，对携载阿霉素的370 Zr02纳米颗粒和荧光染色的细菌 coli E ER2738的检测表明双通道HSFCM可应用于不同材料纳米粒子的分析。 第三章为HSFCM应用于致病菌与总茵数目的同时检测。为实现致病菌与总 nm 菌数的同时检测与定量分析，将HSFCM改进为双荧光检测通道：采用488 激光器作为光源且功率控制在1．0mW，更换二向色滤光片和带通滤光片将检测 通道改进为绿色荧光和红色荧光双通道，且荧光信号分别由两个单光子计数检测 coli coli 器(APD)检测。以致病菌E0157：H7和非致病菌EDH50t作为检测模 型，优化了荧光探针的选择及染色方案，建立了细菌的核酸染色检测体系和致病 菌的单克隆抗体．生物素．亲和素级联放大检测体系。对抗体单染或抗体与核酸共 coli coli 染的致病菌E 0157：H7以及双染的非致病菌EDH5ct分别进行检测与定 量，计数结果与传统的平板计数法均具有很好的一致性，检测限约为105cells／mL。 coli 对于含有不同配比Ecoli0157：H7和EDH5ct的细菌混合样品的检测也取得 了与理论值非常一致的结果。将抗体与核酸共染的双荧光法应用于天然矿泉水中 致病菌的检测，结合离心富集法可使检测限降低到102eells／mL。实验结果表明 HSFCM在致