PPO基因表达析及双孢蘑菇高效表达载体的构建.pdf

麴 摘要 多酚氧化酶(Polyphenol 褐变的关键酶，研究双孢蘑菇不同生长时期以及不同处理条件下PP0基因的表达情 况是进一步研究PPO基因活性的基础。构建合适的双孢蘑菇遗传转化体系、提高转 化率，为从分子水平上研究PPO基因以及双孢蘑菇其他功能基因提供有利工具，对 双孢蘑菇遗传育种有着重要意义。本文研究了双孢蘑菇不同发育时期、不同处理下 PPO基因表达的活性，建立了双孢蘑菇的高效转基因体系，并构建了双孢蘑菇PPO 以双孢蘑菇不同发育时期的子实体以及采后的双孢蘑菇在4℃贮藏条件下取样， 提取双孢蘑菇的总I斟A，并以18S rRNA为参照，利用半定量RT-PCR技术，对不同 采样的双孢蘑菇中PPO基因mRNA的表达情况进行分析。双孢蘑菇中已克隆出的四 克隆双孢蘑菇印d强启动子，并利用印矗强启动子，置换植物双元表达载体 转化的表达载体pC曲g，并导入农杆菌中。通过研究不同转化条件下的转化效率，建 立农杆菌介导的双孢蘑菇的高效转基因体系。结果表明，在农杆菌侵染菌液浓度 度为200umo．1、共培养24h的条件下，转化效率最高，可达70％以上。 根据双孢蘑菇PP03序列，设计特异引物，克隆双孢蘑菇PP03启动子，并置换 表达载体pC：瑚bial301中C心歪V35S启动子构建表达载体pCghP3，并根据表达载体 pC曲g成功转化双孢蘑菇建立的转基因体系，将表达载体pCg”3转入双孢蘑菇中， 实现外源基因PP03启动子在双孢蘑菇中的表达，为研究双孢蘑菇启动子的表达活性 关键词：多酚氧化酶； 双孢蘑菇；印d启动子；PPO启动子；半定量IUPCR；遗传 Abstract to orderto oxidaSe(PPO)isnle of彳g口r配淞6坪硷，-淞．111 P01)，phenol keyenzymeleadingbrowning discussedthe ofPPOuIlderdi髓rent and 缸ther PPO eXpression Stages snJdy gene积iv咄we methodof of improVinge伍ciency conditions．Cons帆ctingproper仃ansfonIlation4．鼬pD，．淞and of tmsfomlationwill a t001for PPO other如nctional providepower缸l studyinggene锄d genes m01ecular are for leVel，and geneticbreedingof么g口厂fc船6印D，螂aLs 彳g钟记淞6碑，D，．螂at meaningnll uIlderdi髓rem andconditions， well．TKsaniclediscuSsedt11e PPO S协ges expressionactiv时of e伍ciem缸锄sfomationmethodandaPPO