产紫杉烷真菌Pstalotiopsis malicola的EMS诱变育种及NK-36b的细胞水平遗传分析.pdf

摘要 摘要 紫杉烷类化合物最初是从植物中得到的天然产物，结构分类属于二萜类， 又称紫杉烷二萜。其中，紫杉醇是一种高效、低毒、广谱、作用机制独特的天 然抗肿瘤药物。紫杉烷类药物的市场供应受制于原料来源和制备技术两方面， 药价昂贵。真菌大规模工业发酵生产具有广阔的发展前景，将产生巨大的社会 效应和市场效益。 本实验室分离得到一株产紫杉烷类化合物的拟盘多毛孢属真菌 Pestalotiopsis 10-DAB在内的多种紫杉烷衍生物。为了提高紫杉烷产量，本文采用化学诱变的 方法对Pmalicola进行诱变育种。实验以EMS作为诱变剂，摸索不同浓度下EMS 得253株突变菌株，并且经HPLC检测，部分突变菌株次生代谢产物含量与野 生型相比明显增多。我们对产紫杉烷衍生物含量增多的突变株进行单孢分离并 多次传代培养，结果表明突变菌株性状遗传稳定。 本实验室通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的原生质体转 化(ATMT)筛选得到一株产紫杉醇能力缺失的转化子Bu95。本文通过反向PCR 和染色体步移方法对插入Bu95的T-DNA左侧翼序列进行了分析并测序。 本论文的另一项重要工作是对本实验室筛选的一株腐生真菌NK．36b进行 细胞水平的遗传分析。NK．36b的次生代谢产物非常丰富，除紫杉烷类化合物外， 其发酵产物中还含有大量的球毛壳甲素，产量高达83megL。通过实验己证明该 菌具有降解纤维素的能力，这些特殊的生物学功能让它在应用领域具有巨大的 潜力。为了更好地对该菌株进行遗传和代谢分子机制研究，本实验完成了NK．36b 的尿嘧啶营养缺陷型敲除载体的构建；并通过光学显微镜和电子显微镜分别对 NK．36b菌丝和孢子的细胞形态及细胞核分布进行观察；同时对NK-36b的定向 敲除基因Tdcl、彳肠1进行PCR和Southernblot分析。 关键词：产紫杉烷真菌；EMS诱变育种；Pestalotiopsis 分析 Abstract named filamentous one fungus Our hasisolatedtaxanes-producing laboratory taxanes itcall includingpaclitaxel， verified produce Pestalotiopsmalicola．and this with andNMR·In andother metabolitesHPLC，LC-MS 10．DAB sencondary withchemical Ot the oftaxanes mutagenesisbreeding production paper,weimproved withdifferent ofPmalicola theletha