人蛔虫CPI基的全长克隆与免疫学功能初步研究.pdf

摘要 摘 要 蠕虫类寄生虫感染可以显著抑制宿主免疫功能这一现象已经被广泛报道，但 对这类寄生虫中起免疫调控作用的分子所知甚少。许多研究表明，蠕虫分泌排泄 产物中的半胱氨酸蛋白酶抑制因子（Cysteine Protease Inhibitor, CPI ）具有显著的 免疫抑制功能，然而其作用机理和应用价值仍需深入研究。 人蛔虫（Ascaris lumbricoides, Al ）是一种人体常见的肠道寄生蠕虫，其体腔 液和提取物具有抗过敏反应、抗肿瘤等免疫调控功能。然而人蛔虫中具有免疫调 控活性的分子有哪些仍然不甚明确。为此，本文针对人蛔虫中的半胱氨酸蛋白酶 抑制因子进行研究。 本研究首先根据已知线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子的保守序列设计兼并引 物，从人蛔虫 cDNA 中扩增得到人蛔虫 CPI 的保守区序列片段。再利用 RACE 技术，成功克隆了人蛔虫 CPI 全长 cDNA 序列。将 Al-CPI 的编码区克隆进原核 表达载体 pET-32a 中，转化大肠杆菌 origami 之后进行诱导表达和亲和层析柱纯 化，得到重组 Al-CPI 蛋白。 重组 CPI 蛋白进行生物活性测定，发现该蛋白可以抑制 Cathepsin B、L 、S、 C 四种组织蛋白酶对其相应底物的水解作用，证明该蛋白具有生物活性。 进一步研究 Al-CPI 的免疫学功能，发现Al-CPI 可抑制由 ConA、PPD 等刺 激引起的人 PBMC 的增殖活性，并可以显著降低PBMC 中ConA 刺激诱导的 IL-4 和 IFN-γ 的分泌。流式细胞术检测 PBMC 中不同 T 细胞亚群的表面分子，发现 ConA 刺激引起的 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞表面 CD25 和 HLA-DR 的表达均被 CPI 抑制。这说明 Al-CPI 具有显著的免疫抑制功能。 在混合淋巴细胞反应（Mixed Lymphocyte Reaction, MLR ）中，Al-CPI 可以 + + 抑制应答细胞中 CD4 T 细胞的增殖能力。MLR 体系中 CD14 单核细胞表面共刺 激分子 CD40、CD80 和 CD86 的表达在CPI 作用下均下调。同时，在 MLR 培养 上清中 IL-12 和 IFN-γ 的分泌均可被CPI 抑制。这说明人蛔虫 CPI 可以抑制同种 异型抗原诱导的淋巴细胞激活，抑制同种异体移植排斥反应。该研究结果表明 Al-CPI 具有潜在的临床药用价值。 关键词：蠕虫感染 人蛔虫 半胱氨酸蛋白酶抑制因子 免疫调控 I ABSTRACT ABSTRACT It has been widely reported that helminth infection can inhibit the immune function of their hosts, however, little is known about the immunological regulation factors in these parasites. Recently, many investigations have demonstrated that cysteine protease inhibitors (CPI), which were found in excretory-secretory products of helminth, can significantly impair the host immune function. However, the immunoregulation mechanism and application value of CPI still need to be studied