化学损伤剂诱导Fen1突变小鼠癌症发生机制的研究.pdf

浙江大学博士论文 摘要 摘要 对各种癌症的观察分析发现，当不同的个体暴露于一定的含致癌物的环境 时，他们倾向于发生癌症的程度是不同的。流行病学的研究表明在外界DNA 损伤的刺激下，个体表现出的不同癌症发生倾向性可能和基因的多样性有关， 如碱基切除修复(BER)相关基因的单核苷酸多态性。为了验证这个长久以来 的假说，并进一步阐明参与BER途径中一个基因(Fenl)的变化是如何导致机 体对环境损伤剂敏感从而产生癌症，我们利用已建立的FENl点突变(E160D) 小鼠展开了一系列的实验研究，并分别从分子水平、细胞水平和小鼠模型三个 层面对相关的机制进行了阐述。 1、构建了FENl点突变库，并对重组蛋白的纯化方法进行了优化。我们沿 用点突变的方法，将FENl各氨基酸位点突变为丙氨酸，并将鉴定后的质粒和 菌株保存入库。另外，我们还优化了FPLC蛋白纯化系统进而得到了极高纯度 的重组蛋白，为后续的大量生化实验奠定了基础。 2、在体外分析了重组蛋白和MEF细胞(鼠胚胎纤维细胞)核粗提物对两 种BER修复过程的中间产物类似物的酶切活性，发现E160D突变的存在会大 大影响FENl蛋白或相应MEF细胞对DNA损伤的切除能力。此外，我们还在 体外比较了MEF细胞的BER修复能力并同时利用纯化的重组蛋白进行了 LP．BER重建。对所得到的放射性产物进行信号强弱比较发现，E160D突变MEF 细胞的BER活性要明显低于野生型细胞：该突变也同时影响了体外LP—BER重 建的效率。 3、研究了在化学损伤剂(MNU和H202)处理情况下细胞水平的变化。 复制叉的瓦解、DNA双链断裂(DSBs)的产生以及引发的染色体畸变，使细 胞内非正常染色体(四倍体和非整倍体)的比例增加。 4、对基因改造小鼠进行一次性的DNA烷化剂(MM7)注射。在对照组小 鼠生长完全正常的情况下，处理的小鼠表现出很高的肺癌发生率，其中尤以 E160D纯合突变鼠的肿瘤恶性程度最高。 ‘。一Ul‘一 浙江大学博士论文 摘要 综上，我们认为BER相关基因(FENl)的～个微小变化(点突变E160D) 会导致机体对碱基损伤的修复能力下降，而当含有这种突变类型的个体处于化 学损伤剂诱导的条件下，会更倾向于罹患癌症。 关键词：FENl、长片段碱基切除修复、MNU、四倍体、非整倍体、癌症 一Ⅳ一 浙江大学博士论文 Abstract Abstract Acriticalobservationin cancersisthatnotallindividualsare sporadic equally tO cancer toa environmental given carcinogen． followingexposure pronedeveloping inthe ofcancer have thatthedifference studiessuggested timing Epidemiological onsetin to DNA is attributabletO damagelikely genetic responseexogenous