大豆磷脂对凋亡关基因及抗氧化能力的影响.pdf

大豆磷脂对学习记忆相关基因及抗氧化能力的影响 摘 要 磷脂是一种纯天然的营养保健品，主要存在于动、植物的细胞中，是细胞膜的主 要组成成分。大豆磷脂可以维持生物膜正常的结构与功能，与细胞的生长、增殖、分 化、癌变紧密联系，其降解产物还参与细胞的信号转导、代谢调控，具有改善记忆、延 缓衰老、调节血脂、抗肿瘤、健脑等多种生理作用。因此本实验研究大豆磷脂对学习 记忆相关基因及抗氧化能力的影响，并探讨其作用机制，为大豆磷脂更好的应用提供 实验依据，进而对神经细胞的保护作用等方面提供新的思路。 实验方法： 1．建立D．半乳糖致衰大鼠模型，将50只SD雄性大鼠按体重随机均分成5组， 即正常对照组、模型对照组、大豆磷脂低剂量组(0．5 g／l(鲥)、中剂量组(1．0g／l(鲋)、 高剂量组(1．5 g／l(g／d)。模型对照组、大豆磷脂组皮下注射D-半乳糖50mg／l【鲥， d测学习记忆， 正常对照组注射等量生理盐水。每天定时灌胃和注射各1次。第30 第45d处死大鼠，取各组织分别测定MDA含量、SOD和CAT活力。 2．建立D．半乳糖致衰大鼠模型，第45d处死大鼠，提取海马和大脑皮层中总 l蝌A，采用逆转录聚合酶链反应(1弭PCR)方法，定量检测其海马和皮层中锨x、 筇?、＆，-2、c如、Ⅳ■M的基因表达。 3．体外培养神经细胞。取出生24h内小鼠，75％酒精消毒，取大脑，剔除脑膜和 血管，剪成l舢n3小块，0．125％胰蛋白酶37℃消化20min，终止消化后1000r／min 离心5min，取沉淀，制成细胞悬液，细胞计数并调整密度至2×106个／mL，接种入 经O．1％L．多聚赖氨酸包被过的培养板内，置37℃、5％C02、‘饱和湿度条件下培养。 24 h后全量换液，接种3d后，再次全量换液，加入含不同浓度大豆磷脂的完全培养 液，继续培养。细胞培养6d后即做下一步实验。MTT法和台盼蓝法检测细胞活力， 收集细胞，分别测定蛋白质总含量、MDA含量和CAT活性。 4．体外培养神经细胞。在倒置显微镜下观察不同时期神经细胞的形态变化，细胞 培养6d后，通过A0忸B荧光染色、Hoechst33258荧光染色、单细胞凝胶电泳观察 细胞结构，扫描电镜观察细胞表面超微结构。 实验结果： 1．与正常对照组相比，致衰大鼠学习记忆能力显著下降(氏O．05)，各组织中MDA 脂具有增强学习记忆力和提高抗氧化能力。 2．与正常对照组相比，模型对照组娜训加与p5．罗／J胁c，切的比值均增大，差 马和皮层组织中研、p乃、纠钿基因表达，提高肌，．2、ⅣC爿M基因表达。 3．MTT染色法结果显示，与正常对照组相比，大豆磷脂10。m咖Irl0。5m幽nL 组神经细胞活力增强，并且随着大豆磷脂浓度的增大，神经细胞活力逐渐增强，大豆 磷脂lO。5 常对照组，说明大豆磷脂的浓度并不是越高越好，而是应该控制在一定的浓度范围内。 台盼蓝染色结果显示各组之间神经细胞存活率差异不显著(尸o．05)。神经细胞中蛋 实验表明，大豆磷脂对神经细胞的抗氧化能力有一定的促进作用。 h 4．倒置显微镜下，细胞接种4h开始贴壁，分布均匀，细胞圆并透明；培养24 后，细胞绝大部分呈梭形，细胞呈立体隆起状，表面光滑，细胞有单极突起出现，少 数细胞还有双极突起出现；培养3d后，细胞主要呈梭形形态，且胞体饱满，细胞突 Ⅱ 起增多、增长，双极和多极突起明显增多，光晕明显，细胞之间开始形成完整的神经 网络结构：培养6d后，细胞呈梭形、三角形等多种形态，胞体明显增大，突起增粗， 增长，突起数量增多。经Ao／EB荧光染色后，正常对照组与大豆磷脂组均呈现荧光 33258染色 深浅不一的结构样特征，核染色质着绿色且细胞形态结构正常。HoechSt 结果显示，正常对照组和大豆磷脂组细胞核形态均规则，呈