大鼠精原干细胞长期培养、鉴定及其特异标记基因表达载体的构建.pdf

大鼠精原千细胞的长期培养、鉴定及其特异标记基因表达载 体的构建 摘要 在雄性哺乳动物睾丸内持续的精子发生是维持其生殖能力的必 Stem Cells，SSCs)是精子 备条件。精原干细胞(Spermatogonial 发生的基础，既可以逐级分化最终产生有功能的成熟精子，又可以自 我更新维持其干细胞的数量。体外对SScs进行分离纯化、培养及其 它操作技术的建立为精子发生过程、雄性辅助生殖、细胞再生治疗和 遗传学的研究开辟了新的道路。鉴于sSCs具有多种潜能和应用前景， 极具研究价值，本研究对大鼠SSCs进行了系统且完整的分离纯化、 长期培养以及体外分化能力的研究。之所以选择大鼠为研究对象是因 为大鼠作为模式动物，能为哺乳动物SSCs的特性和机理研究提供更 多便利和资料。此外，大鼠还具有其他优势，如大小、繁殖力、易于 手术处理、取样方便和便于实验管理等，使其成为特别有吸引力的动 物模型，将为人类健康和疾病的研究提供更多的生理及临床研究数 据。此外，构建可在睾丸SsCs中特异表达荧光蛋白标记的质粒载体， 将能够很方便地辨认SSCs，使得SsCs在体内外关于增殖和分化的动 态变化直观地表现出来，这将大大便利于ssCs的特性和功能的研究。 为此，本研究制备了在睾丸SSCs中特异表达红色荧光蛋白的质粒载 体，若能联合精原干细胞移植技术，制备转基因大鼠，预计该转基因 气 大鼠将在SSCs中特异表达红色荧光蛋白，为后续SSCs体内外的研究 提供实用的细胞模型和动物模型。 1．大鼠精原干细胞的分离和纯化 酶消化法分离得到睾丸曲细精管细胞悬液，根据精原干细胞与曲细精 管细胞悬液中体细胞(支持细胞及少量的管周细胞)及各级分化的生 精细胞贴壁能力及对细胞外基质粘附力的不同，将大鼠精原干细胞进 行纯化。经纯化后5只大鼠的睾丸约可以得到3×105个SSCs。利用 该方法分离和纯化大鼠SSCs，操作简便，且得到的SSCs具有很高的 活力和增殖能力，是一种高效的分离纯化方法。 2．大鼠精原干细胞的体外长期培养 本研究建立了大鼠SSCs体外长期培养系统，该系统以丝裂霉素 mouse andouabain 处理白勺STO(SIMembryo—derivedthioguanine resistant)细胞为滋养层，使用无血清、培养成分明确的培养液， l fibroblast cel 添力口GDNF(basic growth line—derived neurotrophicfactor)，GFR仪1(GDNF—fami1yreceptor 0【1)三个重要生长因子。在该培养体系中，大鼠sscs连续培养超过 6个月，传代超过30代，葡萄串状的SSCs细胞克隆形态保持不变。 该SSCs可在体外任意培养时期进行冷冻保存，解冻后可迅速恢复生 长。该体系的稳定建立，为日后大鼠sSCs的研究和应用奠定了扎实 的基础。 3．体外长期培养大鼠精原干细胞的鉴定 6 本研究运用睾丸冰冻切片免疫荧光染色和曲细精管整段免疫荧 光染色对大鼠睾丸内SSCs的位置分布及形态进行了检测，并证实实 验所用标记基因仞棚，舒№』，尼历是可靠的大鼠SSCs的标记基因。 对长期培养的大鼠SSCs进行分子水平的鉴定。经细胞免疫荧光分析 记基因的蛋白质产物。RT—PcR分析证实了∞明，舒№-，戌历在长 期培养的大鼠SSCs中转录表达，同时还证实了其他SSCs标记基因 c嘞j芒，删侈f2r，萨胎f的转录表达。该鉴定技术简便、可靠，可用 来鉴定体外长期培养的SSCs，为日后SSCs的后续研究奠定了基础， 并为家畜等大动物SSCs体外鉴定提供了借鉴。 4．大鼠精原干细胞体外分化功能的鉴定