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微拟球藻PUFAs相关合成酶基因功能研究与转基因体系的建立 摘 要 多不饱和脂肪酸(Polyunsaturatedfatty 能和人类健康至关重要，尤其是是EPA(Eicosapentaenoic (Docosapemaenoic acid，22：6n3)。海洋微藻是海洋食物链的初级生产者，许多物 种具有从头合成PUFAs的能力且含量较高，其脂肪酸具有组成稳定，不含胆固 醇，没有难闻的鱼腥味和重金属污染等优点，正逐步成为PUFAs的一个重要来 源。 微拟球藻(Nannochloropsis 胞经济微藻，富含的EPA且含量可达到总脂肪酸的30％以上。推测在该藻中存 在高效合成PUFAs的酶系，有望得到具有较高酶活性的PUFAs合成相关的酶基 因资源。本研究克隆得到PUFAs合成途径中的两个合成酶基因—．△6．去饱和酶和 C20．延伸酶基因，并在酿酒酵母真核表达系统中进行了初步的功能验证，分析了 不同培养温度下藻细胞中PUFAs的含量与合成酶基因转录水平、酶活性之间的 关系。同时进行了微拟球藻的转基因体系构建的研究工作，以期在本体内验证酶 基因的功能。论文的具体研究内容如下： 一．分析微拟球藻eDNA文库，发现了一段A6．去饱和酶基因3’端序列，结 个碱基，编码474个氨基酸残基；编码的蛋白序列N端具有Cyt．b5结构，C端 去饱和酶典型特征。在NCBI中进行过BlastX比对发现，该基因编码的蛋白与 三角褐指藻(Phaeodactylum pseudonan)、 alpine)等物 到表达质粒pYES2，转入酿酒酵母(Saccharomy Acid 行功能的初步验证。实验结果显示，该基因编码的蛋白既能催化LinoMc (18：2A9，12)生成7-Linolenic Acid (18：3A9，12，15)生成Stearidnoic 底物分别生成相应的产物。因此，推测该基因编码的蛋白具有A6一去饱和酶的功 能，可同时参与n3和n6途径中的去饱和反应。 微拟球藻PUFAs相关合成酶基因功能研究与转基因体系的建立 二．简并PCR和RACE技术相结合克隆到一个延伸酶的eDNA全长序列。 的序列已证实为延伸酶的酶活性中心：推测该蛋白中有5个过膜区域，分别位于 间，推测该延伸酶可能是属于PUFAs 真核表达系统中进行功能验证发现该基因编码的蛋白只能延伸EPA (20：5A5，8，11，14，17)生成产物Docosapentenoieacid(22：5A7，10，13，16，19)。 三．温度影响细胞生长和PUFAs的相对含量。在10℃～30℃范围内，同一 接种密度(1．5x106cells／mL)的藻细胞在培养温度为25℃时生长最快，指数生 的种类和含量亦不相同。随培养温度的升高，可检测到的脂肪酸种类减少。培养 去饱和酶转化率也是最高，为39．31％。RT-PCR结果显示△每去饱和酶基因的转 录水平在5个不同培养温度下的藻细胞中差异显著，最高转录水平出现在15℃ 培养的藻细胞中(Ct值为21．45)。实验只检测到了延伸酶基因最高的转录水平 出现在20℃培养的藻细胞中(Ct值为21．418)，未能检测到该酶作用的底物和产 物。结果证明，PUFAs含量最高的培养温度要比最适生长的培养温度低；转录 水平最高的培养温度要比酶活性最高培养温度偏低；转录水平并不能代表酶活性 的高低。 四．微拟球藻转基因体系构建包括敏感抗生素的筛选，原生质体的制备，表 达质粒的选择，转基因藻株的筛选与鉴定4部分工作。从5种抗生素(新霉素、 链霉素、潮霉素、博来霉素和壮观霉素)中筛选到该藻敏感的抗生素一博来霉素， 液体培养基敏感浓度为lpg／mL，固体培养基敏感浓度为O．5岖／mL。终浓度为 4％半纤维素酶和2％崩溃酶的酶混合液处理细胞密度为2x10‘7eells／mL的藻细胞 lh，原生质体的制备率最高，并可再生。获得带有博来霉素抗性的基因(砒， 来源于S