尼罗罗非鱼翻译伸因子eEF1A家庭的分子克隆和表达研究.pdf

摘要 尼罗罗非鱼翻译延伸因子eEFlA家族的分子 克隆和表达研究 水生生物学专业硕士研究生魏莹莹 指导教师：王德寿教授 摘要 translation factor1A，eEFlA)是广泛 翻译延伸因子1A(eukaryoticelongation 存在于所有生物许多类型细胞的一类含量丰富且高度保守的蛋白质家族。它属于G 蛋白家族，在肽链延伸过程中作为翻译延伸复合物的一部分，促使GTP依赖的氨酰 黄发生前期卵母细胞中发现。大量研究表明eEFIA家族通常含有多个成员；在不同 物种的不同发育过程中，eEFlA存在许多组织和时期特异表达的亚型，如鸟类、哺 在性腺中的表达、作用等鲜有报道。为解决上述问题，本研究从尼罗罗非鱼中克 隆-J42Sp50基因，从3月龄罗非鱼雌、雄性腺转录组序列中分离得到另外三个不同 和原位杂交等方法重点研究-J42Sp50和eEFlAb的表达模式，其结果如下： 42Sp50 下载到的各代表物种的eEFlAs序列，我们构建了系统进化树，发现斑马鱼中有五 栖类和真骨鱼类中找到，它与其他eEFlAs分开，单独聚为一枝且位于系统进化树 西南大学硕士学伊论文 和42Sp50分离的基因复制发生时间相对较近，随后编码42Sp50的基因快速进化的 观点。 通过RT-PCR发现eEFlAlb在卵巢和精巢中均有表达，且在精巢中的表达明 显高于卵巢，42Sp50则特异地表达于卵巢中。同时，我们发现42Sp50在雌激素诱 导的雄鱼卵巢中高表达，而在芳香化酶抑制剂处理后的雌鱼精巢中完全被抑制。 因型无关，只与表型(雌性卵巢或雄性精巢)相关。进而，通过Real．timePCR研 究了42Sp50和eEFlAlb基因在罗非鱼个体发生过程中雌、雄性腺的表达模式，结 果表明42Sp50从孵化后10天开始在卵巢表达，随发育进程逐渐升高，至孵化后 60天表达量达到最高，此后逐渐降低。相反，在雄性性腺发育过程中其表达始终 保持在本底水平。罗非鱼雌、雄性腺中，孵化后10天至70天，eEFlAlb仅有微 量表达。从孵化后90天开始，eEFlAlb在精巢中的表达剧增，并于孵化后120天 达到最高，随后逐渐降低，在孵化后240天又一次增高，但这期间它在卵巢中始 在罗非鱼性腺表达的细胞类型，结果显示在卵黄发生前期卵母细胞细胞质中， 碰：丌彳J6和eEFlA4在精巢的初级和次级精母细胞中表达，且eEFlA4的表达量明 则没有表达。本研究进一步采用荧光素酶报告基因研究了HEK293和CHO细胞中 I 胞系中，三种雌激素受体都抑制了42Sp50的启动子活性。此外，本研究用pCold 载体在大肠杆菌中表达、纯化了N端带有His标签的42Sp50重组蛋白，并免疫小 鼠制备了多克隆抗体，Westernblot检测证实抗体工作良好。 综上所述，本研究发现罗非鱼中共有五个eEFlA家族基因：42Sp50、葩刃彳J口、 在明显的性别二态性，42Sp50在卵黄发生前期卵母细胞中特异表达，而eEFIAlb 主要在初级和次级精母细胞中表达：荧光素酶分析发现三种雌激素受体对罗非鱼 42Sp50启动子活性都有抑制作用。本研究为初次发现雌雄性腺可能分别通过不同 的蛋白质翻译延伸因子进行性别特异的蛋白质合成。 关键词：尼罗罗非鱼eEFlA家族系统进化分析性N--态性重组蛋白和抗体制备 启动子分析 Ⅱ Abstract Molecularand of cloningexpression translationelon gation Nile ·’ ．thetilapia