家蚕蜕皮激素受和超气门蛋白基因的启动子分析.pdf

家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的启动子分析 中文摘要 家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的启动子分析 中文摘要 20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)在昆虫的蜕皮和变态期间扮演着重要的 角色，包括形态发生，细胞凋亡，繁殖和行为反应等过程。蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle, USP)是核受体超家族的成员，是20E 的分子 靶标。因此研究家蚕EcR和USP基因在蜕皮激素诱导下的表达调控具有一定的理论意义。 构建FHNLuc-A3RL 双荧光质粒，其中萤火虫荧光素酶(FLuc)基因由BmEcR 和 BmUSP 基因不同长度的启动子片段启动，另一个由家蚕actin3 启动子启动的海肾荧 光素酶(RLuc)作内参基因。通过Bac-to-Bac 系统制备重组杆状病毒，将这些重组病毒 分别注射五龄家蚕，测定组织中各启动子片段的荧光素酶活性。结果表明：无论在正 常条件还是20E 诱导下，BmEcR-A ，BmEcR-B 1 和BmUSP 基因各启动子片段在脂肪 体中的活性较高，而在中肠和马氏管中的活性较低。在BmEcR-A 启动子中，-637 ~ -518 bp 和-278 ~ -177 bp 之间为重要的调控区域；而在BmEcR-B 1 启动子中-325 ~ -198 bp 之间为重要调控区域；在BmUSP 启动子中，-485 ~ -374 bp 之间为重要的正调控启动 子区，而在-374 ~ -281 bp 之间为负调控因子结合的序列。 为进一步对BmEcR-A 的重要启动子区进行功能分析，构建不同长度顺次缺失以及 重要区域突变的pGL3-Basic重组质粒，与内参载体pRL-TK共转染BmN细胞。结果表 明：在BmN细胞内它们的启动子活性都能被蜕皮激素诱导。EcR-A 启动子转录起始位 点上游-637 ~ -612 bp之间为核心启动子区，但是删除-197 ~ -177 bp序列后其启动子活 性明显增加了，说明在该区域存在有抑制因子结合位点。生物信息学分析表明-637 ~ -612 bp之间存在HSF转录因子的结合位点，而在-197 ~ -177 bp之间则没有预测到转录 因子结合位点。 为进一步分析-197 ~ -177 bp之间与之结合的转录因子，利用链亲和素琼脂糖树脂 技术，通过设计生物素标记的探针，与家蚕脂肪体核蛋白抽提物孵育，洗脱，纯化后 进行蛋白质SDS电泳分析并利用质谱技术鉴定，结果显示，在-197 ~ -177 bp之 I 中文摘要 家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的启动子分析 间可能结合有家蚕转酮醇酶蛋白。 对BmEcR-B 1和BmUSP 的重要启动子区进行功能分析，构建不同长度顺次缺失的 pGL3-Basic重组质粒，与内参载体pRL-TK共转染BmN细胞。结果表明：在EcR-B 1启 动子中-325 ~ -295 bp之间包含重要的调控因子对于EcR-B 1基因启动子的转录调控是 必要的。序列分析这一区域显示包含有Dfd和HSF转录因子的结合位点；在BmUSP启 动子中，-485 ~ -445 bp之间含有正调控因子结合位点，而在-307 ~ -281 bp之间认为可 能含有抑制因子结合位点，分别对其生物信息学分析显示含有AP-1和Dfd转录因子的 结合位点。 总之，本研究通过检测家蚕BmEcR 和BmUSP基因启动子在家蚕组织中的萤光素 酶活性并找到一些重要的调控区域。并且进一步在BmN细胞水平上对这些重要的调 控区域进行分析得到了BmEcR 和BmUSP基因的核心启动子区以及相关的蛋白因子。 这项研究为进一步鉴定EcR和USP 的顺式作用元件和反式作用因子以及阐明EcR 和 USP组织特异性表达提供了重要的基础。 关键词：家蚕；BmEcR-A ，BmEcR-B 1和BmUSP ；双荧光素酶报告基因系统；转录 调控；启动子 作 者：黄明霞