抗菌肽LfaminBLfcinB基因的设计合成及表达产物的活性鉴定.pdf

摘 要 摘 要 乳铁蛋白（Lactoferrin ，LF ）最初是从牛乳中发现的，具有抗菌、抗病毒、消除 炎症和免疫调节等多种生物学功能。牛乳铁素（Bovine Lactoferricin ，LfcinB ）和牛 Lactoferampin （LfampinB ）是bLF N1 端在空间结构上靠近的两个活性区域，由蛋白 酶在水解条件下产生，抗菌活性都强于 bLF 。目前有研究证实，LfampinB 与 LfcinB 组成的嵌合结构肽的抗菌作用比两者任一都强。因此，嵌合结构肽在替代传统抗生素 方面将会有广阔的应用前景。 本文旨在通过构建 LfampinB/LfcinB 高效表达载体，分别利用原核表达与真核表 达的方式制备出抗菌肽，用于疾病的防治。根据 LfampinB 和 LfcinB 的结构特点及它 们的抗菌机制，设计合成了 LfampinB/LfcinB 重组基因序列。将 LfampinB/LfcinB 基 因与 pPL-SD 质粒连接构建中间载体，并在此基础上构建了 pME290-SDLfa/Lfc 原核 表达载体。利用毕赤酵母系统中分泌型表达载体 pPIC9K 的多克隆位点，将合成的重 组 LfampinB/LfcinB 基因克隆后插入 pPIC9K 载体，经限制性内切酶鉴定、PCR 检测 和测序分析正确后，成功构建真核表达载体 pPIC9K-Lfa/Lfc 。 将重组质粒 pME290- SDLfa/Lfc 转化绿脓杆菌感受态细胞表达，离心收集上清， 浓缩后经 SDS分析，结果在约 16kDa 的位置有目的条带，表明构建的原核表 达系统表达出目的蛋白。真核表达载体 pPIC9K-Lfa/Lfc 转化酵母宿主菌 GS115, 筛选 到 G418 高抗性的甲醇利用型（Mut+ ）转化子。研究发现，经 0.5～1.0%甲醇诱导发 酵 72h，LfampinB/LfcinB 融合蛋白可大量表达并分泌到培养物上清液中，SDS 分析目的蛋白大小约为 10kDa，且经凝胶薄层扫描测定LfampinB /LfcinB 融合蛋白表 达量为 0.23mg/mL 。 对原核表达与真核表达产生的融合蛋白作抗菌试验，结果发现原核表达产生的融 合蛋白抗菌作用不明显，真核表达产生的融合蛋白对细菌 6 个属中的大肠杆菌、坏死 梭杆菌、魏氏梭菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌 10 个菌株均有抗菌活性。 本项研究研制出的 LfampinB/LfcinB 融合蛋白有望成为安全、有效、广谱的抗菌 新药。 关键词 牛 Lactoferampin ；牛乳铁素；绿脓杆菌；毕赤酵母；融合表达 -I- Abstract Abstract Lactoferrin was first isolated from bovine milk, and it has many biological functions, including antibiosis, antivirus, anti-inflammatory, immunological regulation etc. Bovine lactoferrampin (LfampinB) and bovine lactoferrcin (LfcinB) are two antimicrobial fragments, situated in close proximity in the N1-domain of bovine lactoferrin (bLF). They are released by proteolytic digestion of bLF, and their antibacterial activities are more