斑马鱼心脏发育选基因HPRG1相关品系的建立及初步功能研究.pdf

摘 要 心脏是脊椎动物最早发育并行驶功能的器官之一，其发育过程 受到多种基因的表达调控。这些基因的表达异常会导致不同类型的 心脏缺陷。在我国约有1000万先天性心脏病患者，这类疾病己上升 为人类的头号杀手，因此，研究心脏发育的调控基因，有助于更好 地了解心脏病的发病机制以及对该类疾病的防治。斑马鱼作为一种 理想的模式动物，具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、 体外受精、胚胎体外发育且透明等优点，其基因组与人类的相似性 达到了87％，因此使用斑马鱼作为脊椎动物发育生物学模型研究心 脏发育的基因调控机制具有极大的优势。 本室的前期研究显示，斑马鱼基因HPRGI可能参与心脏早期的 形态建成，与Smad蛋白相互作用，通过BMP信号途径在心脏发育 中发挥重要的调控作用。本论文以斑马鱼为模型继续研究HPRGl 基因在脊椎动物心脏发育中的功能。 本论文首先通过整体胚胎原位杂交研究HPRGl基因在斑马鱼 胚胎发育中的表达模式。实验结果表明，HPRGl基因在胚胎发育的 早期开始表达，在发育晚期定位于心脏组织特异性表达，这与本室 前期的胚胎免疫荧光实验结果相符合。其次，本文利用T012转座子 系统构建了一系列与斑马鱼心脏候选基因HPRGl相关的转基因斑 马鱼品系，其中已成功建立的可稳定遗传的品系包括：Tg?pTol2 (cmlc2：HPRGl-EGFP)、rgj 7 对pTol2(cmlc2 HPRGl基因在心脏过表达导致围心腔变大、心脏不能正常环化及心 室缩小、心房膨大等缺陷表型。利用斑马鱼M．mode生理学研究技 术，进一步证明HPRGl基因对心脏生理学功能起着重要的调控作 3kb的启动子限制HPRGl基因在心脏组织特异性表达，其表达模式 与之前的原位杂交表达模式相符合。另外，本文还利用T012转座子 7 系统建立了pTol2(cmlc2 分析表明，该品系在心脏特异性表达CRE重组酶，对心脏的正常发 育没有明显影响。该品系的成功建立为利用条件基因打靶技术研究 斑马鱼候选基因在心脏发育与相关疾病中的功能奠定了基础。 本论文利用近几年兴起的CRISPR／Cas9打靶技术建立斑马鱼 HPRGl基因敲除系。首先经网站分析筛选出HPRGl基因最合适的 鱼单细胞期胚胎。以提取的24hpf胚胎基因组为模板进行PCR扩增 和酶切检测，证明该表达载体能有效地诱发基因突变。斑马鱼 HPRGl基因的稳定敲除模型正在构建中。 关键词：HPRGl，斑马鱼，转基因，心脏发育 II ABSTRACT Heartis of onetheearliest andfunctionalof developmental organs its is alotof vertebrate，and developmentprocessregulatedby genes． Theabnormal ofthese resultindifferentcardiac expressiongenesmay defects．Inour areabout10million sufferfrom country,there patients heartdiseaseandthiskindofdiseaseisknownasthenumber congenital onekillerof onthe of human．Therefore，researches regulato