杜氏盐藻FLA多克隆抗体的制备及其在食管鳞癌细胞中的定位.pdfVIP

摘要 杜氏盐藻FLA8的多克隆抗体制备及其在 食管鳞癌细胞中的定位 硕士研究生侯永杰 导 师薛乐勋 郑州大学生物工程系细胞生物学研究室郑州450001 摘 要 M 杜氏盐藻是一种能在0．5—5NaCl盐浓度下生存的真核无细胞壁单细胞具 有双鞭毛的藻类生物，其对生长条件要求比较简单且相对容易培养。它具有的 p 等长鞭毛长度大约13m，该鞭毛结构为典型的“9+2’’结构【lJ。杜氏盐藻鞭毛 经过机械法或者醋酸等简单处理后脱掉的鞭毛可发生再生和重吸收现象【23J。实 验室中在光学显微镜下很容易观察到杜氏盐藻鞭毛的形态变化，其直观的形态 结构非常适合作为研究鞭毛结构组装和纤毛相关性疾病研究的模式生物。 鞭毛／纤毛是一种在多种低等动物或高等动物细胞表面存在的一种特殊细胞 器，它不仅参与细胞通讯和细胞信号转导、细胞周期调控，还参与细胞运动等 细胞功能，这些功能对维持细胞正常生理活动至关重要。已有的研究表明鞭毛／ 纤毛的结构和调控异常与多种人类疾病的发生密切相关，如组织的左右不对称、 Kartagencr综合症、多囊肾、多指／多趾等。因此研究鞭毛／纤毛的调控机制对解 决这些疾病的发生和发病机制具有重要的生命意义。目前，人们对鞭毛／纤毛的 组装调控机制的研究还处于初级阶段，对鞭毛／纤毛参与相关生命调控的具体过 程尚不明了。现已有的研究显示鞭毛／纤毛的组装是一个双向的运输的过程，既 正向运输与逆向运输在同一时期进行物质运输。鞭毛／纤毛的组装是由鞭毛内转 运颗粒(Intraflagellar 组装过程所需要的“cargo即货物运输到鞭毛组装部位。鞭毛有动力蛋白和驱 动蛋白两个马达蛋白：在驱动蛋白ATP酶水解能量的驱动下，使货物载体沿细 摘要 胞骨架微管蛋白从基底部运送至鞭毛顶端，在鞭毛的正向端卸下货物，用来组 装微管。IFT运载体颗粒在鞭毛J下向顶端部位回转，将微管解聚后的物质在动力 蛋白作用下沿细胞骨架微管回到鞭毛基部。也就是说，鞭毛的长度是个动态再 生和重吸收的变化过程，即呈现踏车现象。当IFT运载体在鞭毛上的正向端的 运输货物的速率大于逆向运输货物的速率时，鞭毛长度呈现增长的趋性，即为 鞭毛再生过程。反之，当逆向运输速率大于正向运输速率时，有利于鞭毛解聚 过程，即为鞭毛重吸收过程。研究表明在细胞分裂过程中，鞭毛长度会发生周 期性的再生与重吸收，鞭毛长度的变化可能作为细胞周期调控的信号外在表现 【41。在其他的一些纤毛相关性疾病中，能观察到鞭毛长度变化的异常现象。 鞭毛内颗粒IFT从鞭毛的基体沿着微管丝向鞭毛正向端的顶端部运输属于 正向运输，这一过程是由驱动蛋白kinesin-2介导完成的，而由鞭毛正向顶端部 向基体的逆向运输是由动力蛋白dynein介导运输完成的。因此，驱动蛋白．2是 作为驱动蛋白家族的一员，是～个对鞭毛的组装有重要作用正末端指向的驱动 蛋白。驱动蛋白．2的结构是有两个轻链和两条重链组成的四聚体，从外观看具 有两个球形的头部、中间的一个螺旋状的杆和两个呈现扇子状的尾。微管马达 蛋白通过结合和水解ATP得到能量，导致结构的颈部发生构象改变，使两个头 部相互交替地与微管结合，从而使马达蛋白沿微管“行走”，将结合的“货物 转运到其他地方。在低等生物和高等生物中都存在Kinesin．2，但其命名不同。 在高等生物人类及鼠类中命名为KIF3A和KIF3B脑F3C的两个动力结合区域和 一个非动力结合性驱动蛋白KAP3亚基单位。而Kinesin．2在藻类等低等生物中 命名为FLA8和FLAl0动力蛋白亚基和一个非动力蛋白亚基，即结合蛋白亚基 KAP。 本研究是在FLA8已研究的基础上，以GenBank上登录的序列设计引物克 Frame，ORF)，构建了原 隆了FLA8基因cDNA的开放阅读框(OpenReading 纯度的FLA8蛋白。通过应用高纯度的FLA8蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔， 获得了兔抗FLA8的特异性多克隆抗体。利用多克隆抗体检