杜氏盐藻S-腺高半胱氨酸水解酶基因SAHHase在鞕毛长度调控中的作用.pdfVIP

摘要 杜氏盐藻S．腺苷高半胱氨酸水解酶基因 SAHHase在鞭毛长度调控中的作用 摘要 杜氏盐藻是一种高度耐盐的单细胞真核藻类，生长条件要求简单，容易培 养，具有一对等长的鞭毛，长度大约13 gm左右，结构为典型的“9+2结构【l】， 经过简单处理鞭毛可发生再生和重吸收【23】。鞭毛的形态变化在光镜下容易观察， 非常适合作为研究鞭毛结构组装的模式生物。 鞭毛是一种在多种细胞表面广泛存在的细胞器，参与细胞信号转导、细胞 周期调控、细胞运动等，对维持细胞生命活动至关重要【4】。鞭毛结构和调控异常 与多种疾病的发生密切相关，如多囊肾、Kartagener综合症等。因此研究鞭毛的 调控机制对解决这些疾病的发生有重要意义【5】。鞭毛的组装调控机制目前研究还 比较初级，具体的过程尚不明了。现有研究显示鞭毛的组装是一个双向的过程， 既正向运输与逆向运输同时进行。IFT颗粒作为运输体，携带鞭毛组装所需 “cargo”，也称为货物，在动力蛋白kinesin驱动下，沿微管蛋白运送至鞭毛顶 端，在顶端卸下货物，组装微管。IFT颗粒在鞭毛顶端转向，携带微管解聚的产 物，在动力蛋白dynein的驱动下沿微管返回鞭毛基部【6】。鞭毛的长度调控主要 包括再生和重吸收。当鞭毛的正向运输速率大于逆向运输速率时，鞭毛长度增 长，即为鞭毛再生。当逆向运输速率大于正向运输速率时，鞭毛趋向于解聚， 长度发生缩短，即为鞭毛重吸收。在细胞分裂过程中，鞭毛会发生周期性的再 生与重吸收，鞭毛长度的变化可能是细胞周期调控的信号【41。同时在一些疾病中， 也会观察到鞭毛的长度异常。 s一腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHHase)是真核生物甲基化途径中的关键酶， 催化甲基转移反应的产物S一腺苷高半胱氨酸水解生成高半胱氨酸与腺苷，抑制 其活性可问接抑制甲基转移酶活性，进而抑制甲基化作用【71。Schneider证实在 莱茵衣藻鞭毛重吸收过程中蛋白甲基化通路被激活【8】。虽然Pazour等证实S．腺 苷高半胱氨酸水解酶(SAHHase)是鞭毛膜基质蛋白组分之一【9】’但目前关于 摘要 SAHHase在鞭毛长度调控中是否有一定的作用，尚无定论。 为研究作为鞭毛组分之一的SAHHase是否参与鞭毛长度调控，本研究选用 杜氏盐藻作为模式生物，通过对多个物种SAHHase蛋白保守序列进行比对，设 计一对兼并引物，进行RT-PCR，扩增得到327 bp的片段，使用NCBI数据库对 测序结果进行Blast分析，结果显示所得片段与莱茵衣藻SAHHaseeDNA的同源 性为83％，所得片段为杜氏盐藻SAHHasecDNA的一部分。根据所得片段再设 计引物，进行RACEPCR，扩增得到SAHHasecDNA的3’末端与5’末端。进行 1458 拼接，所克隆的杜氏盐藻SAHHase基因eDNA全长1926 bp，包含ORFbp、 3’UTR61 407 bp和5’UTRbp。首先研究在转录水平上，SAHHase基因是否与 鞭毛的再生与重吸收相关。通过机械研磨法去除杜氏盐藻鞭毛，正常条件下培 养，使鞭毛再生，通过秋水仙碱处理使鞭毛重吸收，在再生与重吸收过程中取 不同时间点的藻提取RNA，反转录为eDNA，进行实时荧光定量PCR，结果显 示，在鞭毛再生与重吸收的过程中，SAHHasemRNA转录量有明显升高。进一 收相关，首先进行原核表达，纯化蛋白，制备抗体。原核表达纯化的蛋白纯度 达到90％以上，完全符合制备抗体的要求，将纯化蛋白免疫动物，制备得到效 价符合要求的抗体。 SAHHase是甲基化途径中的关键酶，本研究证实至少在转录水平上， SAHHase与鞭毛的长度调控相关。而最近也有研究显示在鞭毛的长度调控过程 中，部分鞭毛蛋白会发生甲基化与去甲基化的转变，并且有多个甲基化途径中 的组分定位于鞭毛上，据此可以推测甲基化可能参与了鞭毛的长度调控【l们，本 研