杜氏盐藻类钙调蛋白1.3A晶体结构研究及KCBP马达区的表达、纯化与结晶.pdf

摘要 摘要 钙调素是一种高度保守的酸性蛋白质，普遍存在于真核生物细胞内。它可 以感受cE+浓度变化，在信号传导通路中将Ca2+浓度的改变直接或间接的传递 给效应蛋白，实现对基因表达、蛋白质合成、细胞凋亡、神经递质传递、肌肉 收缩、激素合成等众多生理过程的调节。随着结构生物的发展，PDB数据库中 已经提交了包括原生生物、植物和动物在内的钙调素、钙调素突变体及钙调素 和靶蛋白复合物的三维结构，阐述了钙调素发挥生理功能的结构基础。高等生 物中通常存在多种钙调素，结构上的细微差别使它们具有不同的生理功能。藻 类钙调素报道已久，但至今未见有三维结构报道。 本研究中我们构建了杜氏盐藻类钙调素蛋白的原核表达载体，并在大肠杆 菌BL21(DE3)中表达该蛋白。依次通过疏水层析、离子交换层析和凝胶过滤层 mM 析，获得了满足生长晶体纯度的蛋白样品。20 CaCl2， mg／ml的目的蛋白在4 48％MPD，15％乙醇，0．1 M乙酸．乙酸钠缓冲液(pH5．5)，4℃生长二周后获 得适合于x射线衍射的针状晶体。捞取晶体冻于液氮，利用上海同步辐射光源 进行衍射。HKL2000软件分析处理收集的数据，确定出此条件下生长出的杜氏 盐藻类钙调素蛋白晶体的空间群为P21212型。晶胞参数：a=72．667A，b= 79．426 A。c=28．359 A．o．--[BW--900。以1GGZ为模型，分子置换法获得相角， A的三 用CCP4、CNS软件包和COOT软件解析结构。最终获得分辨率为1．6 维结构模型。 A2，主链平 R因子为0．228，R触因子为0．259。模型的平均温度因子为28．747 A2，侧链平均温度因子为31．610A2，具有良好的立体化 均温度因子为25．967 学性质。从整体上讲该结构与其他物种的钙调素无较大差别，均呈哑铃型。但 是中央螺旋较大的柔性使两端“球形区’’的取向与其他钙调素模型存在差异。 N端疏水凹槽内含有3个Met，这相同于植物不同于动物；而C端疏水凹槽内 含有4个Met，这又相同于动物不用于植物。因此我们根据Met的分布推断杜 氏盐藻类钙调素蛋白与靶蛋白的亲和力可能介于动物和植物之间。 摘要 驱动蛋白是分子马达的一种，整个分子分为头部、躯干和尾部。头部马达 区的构象会伴随着ATP的水解发生改变，将化学能转化为机械能，拖动细胞内 的“货物”沿微管定向运动。驱动蛋白在囊泡运输、染色体分离、细胞器定位 等生命活动中发挥重要功能。类驱动蛋白钙调素结合蛋白隶属于驱动蛋白．14 家族，为负向运输型驱动蛋白。已经证实高等生物体内钙调素可以与该蛋白相 互作用。土豆类驱动蛋白钙调素结合蛋白C末端区域的晶体结构已经获得解析。 然而藻类该区域的晶体结构一直未见报道，更没有该区域与钙调素复合物的晶 体结构报道。 我们已经获得杜氏盐藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白的氨基酸序列，为了进 一步研究藻类驱动蛋白的特点，构建了杜氏盐藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白马 达区的原核表达载体、C末端的原核表达载体和C末端突变体的原核表达载体。 16℃诱导大肠杆菌BL21(DE3)表达目的蛋白。依次使用亲和层析、离子交换层 析、凝胶过滤层析，获得满足生长晶体纯度的蛋白样品。三种蛋白独立使用商 业化试剂盒大规模搜索结晶条件，但是未能获得蛋白质晶体。凝胶过滤层析、 pull．down和ITC证实杜氏盐藻的类驱动蛋白钙调素结合蛋白可以和类钙调素 蛋白相互作用。并且ITC结果显示类驱动蛋白钙调素结合蛋白与类钙调素蛋白 的作用比例可能为2：l。杜氏盐藻类驱动蛋白钙调素结合蛋白的C末端与类钙 调素蛋白复合物搜索了大量结晶条件，未能获得复合物的晶体