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条斑紫菜功能基因组及重复序列特征研究 摘要 条斑紫菜是具有重要经济价值和科学研究价值的大型红藻，是潮间带藻类抗 逆分子生理学研究的理想模式物种。但是，目前对于其基因组信息知之甚少，对 其环境耐受机制以及分子育种研究也都非常欠缺。本论文通过对条斑紫菜功能基 因组及重复序列的全面系统研究，深入了解条斑紫菜转录组特性和基因组结构特 征，为其抗逆育种和栽培技术改良提供重要参考。 本论文主要包括以下内容：利用Solexa技术结合生物信息学方法对胁迫条 件下的条斑紫菜转录组及小RNA进行深度测序分析；利用软件筛查条斑紫菜基 因组及转录序列中的重复序列并进行比较分析；利用富集文库法筛选条斑紫菜和 坛紫菜基因组微卫星标记并用于纯系鉴定和遗传分析。 主要结果如下： (1)利用Solexa技术对不同生理状态和不同胁迫处理的条斑紫菜混合样品进 行测序，共获得13，333，334条高质量序列，碱基总量为12x109nt，组装后得到 31，538条平均长度为419 比对分析，发现前者对后者有非常高的覆盖率，也证明了获得的序列绝大多数为 条斑紫菜中的新序列。通过与数据库进行比对，发现条斑紫菜转录组中包含大量 在其他物种中与光适应、失水适应以及抗氧化机制相关的功能基因，并且发现了 红藻中未曾报道过的超氧化物歧化酶类型。通过KEGG分析，发现了条斑紫菜 中的120条代谢途径，其中包括一条几近完整的与高等植物类似的C3／C4碳固定 途径和其他与抗逆机制相关的代谢途径。与数据库比对之后，仍有56．6％的 Unigene没有找到同源序列，说明测序结果中可能存在大量的功能未知的新基因。 (2)通过对胁迫条件下条斑紫菜小RNA的Solexa深度测序，共获得高质量 nt的RNA 序列8,262，593条，其中以22 tags数量最多，筛选其中表达量大于1 均没有注释。利用条斑紫菜的GSS数据进行miRNA前体预测，共找到8条符合 前体标准的新类型miRNA，靶基因预测结果表明，其中6条miRNA参与调控 10个靶基因的表达，而这些靶基因绝大部分参与生物代谢、物质转运及信号转 导过程。 (3)通过对基因组序列和转录序列中的重复序列进行筛查和比较分析发现： 在条斑紫菜中，小卫星重复总长占基因组不到2％，拷贝数较低，以四碱基组成 类型最为丰富，且明显富含GC。基因组序列中的小卫星与转录序列中的小卫星 相比在拷贝数、数量及长度比例上均略低。微卫星序列在基因组中的长度比例不 到0．4％，拷贝数主要分布在9次以下，以三碱基重复类型最为丰富，五碱基重 复类型最少，CCG是最为丰富的基序。基因组序列中的微卫星与转录序列中的 微卫星相比，出现频率低，长度比例高。在条斑紫菜中，散布重复序列均由RNA 转座子和DNA转座子组成，且前者比例远高于后者。RNA转座子中LTR数目 最多，LINE次之，SINE最少。在所有转座元件中gypsy数目最多。基因组序列 中的转座元件与转录序列中的相比，出现频率高，长度比例也高。总之，条斑紫 菜基因组序列中的重复序列总长度比例约为6．5％，明显高于转录序列中的相应 比例，而出现频率却相对较低。 (4)首次通过富集筛库法，获得24对条斑紫菜微卫星引物。利用其中12对 引物对青岛汇泉湾野生群体进行微卫星位点评估，共获得29个等位基因，平均 每个位点的等位基因数目为2．42，有效等位基因数目为1．81。利用24对引物分 析11个不同地域来源的条斑紫菜丝状体，聚类结果显示这11个个体根据地域的 差别被明显地分为两支。利用微卫星标记分析单个叶片的扩增条带，发现同一位 点两条不同带型的序列差别在于微卫星重复次数的不同。利用数据库搜索法和富 集文库法，分别得到9对和14对有较好扩增谱带的坛紫菜微卫星引物，并且通 过实验证明了这些标记在遗传分析中的实用价值。 关键词：条斑紫菜；转录组；microRNA；重复序列；微卫星 i i thefuncti onaI and CharacterstCSof genome r i ti ve i n is epet sequence