柱花草诱导抗性抗病基因类似物的表达特性.pdfVIP

摘要 摘要 柱花草是热带亚热带地区种植的优良豆科牧草。热研二号柱花草1973年由国际热带农业 (StyIo鲫thr∞nose)为严重危害柱花草的生产和推广的主要病害。 本研究从广西南宁畜牧研究所采集病样(病叶及病茎)，于实验室进行单孢分离、纯化培 养，得到单孢分离菌株命名为GX021001，并对该菌株致病性进行鉴定。该菌属半知菌亚门 刺盘孢属的胶孢炭疽菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz．)Pcnz．andSacc]，并且3个供试的 柱花草品种侵染该菌株时的抗病症状表现与它们的抗病性相符。 本研究采用0．Olmmol／L和0．5mmol／L两个水杨酸浓度，统计水杨酸诱导柱花草对炭疽 病抗性的病情指数，并测定POD、CAT、PPO的酶活性，分析水杨酸对柱花草抗炭疽病相关 酶活性的影响。研究结果表明：用0．01mmol／L水杨酸处理的柱花草的病情指数为42．0，而用 蒸馏水处理的柱花草的病情指数为56．0，说明水杨酸具有诱导抗病效果，并且浓度为0．0l mmol／L的水杨酸的抗病效果较好。接种炭疽菌72h后，O．01mmol／L水杨酸处理的POD活 性和0．5mmol／L水杨酸处理的POD的活性分别是对照的O．47倍、O．57倍。接种72h后，水 杨酸处理的POD离子态和共价态活性也明显低于对照，说明了水杨酸对POD有抑制作用。 浓度为O．01mmol／L的水杨酸的CAT和浓度为O．5mmol／L的水杨酸的CAT活性分别是对照 mmol／L 的0．44倍，0．82倍，说明用水杨酸处理能有效抑制过氧化氢酶的活性。浓度为0．5 的水杨酸的PPO是对照的1．1l倍，而浓度为O．01mmollL的水杨酸的PPO为对照的2．56倍， 说明了水杨酸处理诱导了防卫反应中关键酶PPO的产生。 本研究以柱花草叶片为材料，比较了SDS／酚抽提法、CTAB法、Trizol试剂盒和柱式植 物RNAout试剂盒法提取柱花草总RNA的质量和纯度。结果表明：改良CTAB法和柱式植 大予2．0。凝胶电泳结果表明，改良CTAB法有28SrRNA和18SrRNA两条清晰的条带，且 无降解；柱式植物RNAout试剂盒法有四条清晰的条带且无降解。其他两种方法获得的RNA 品质较差，有降解和弥散现象。将改良CTAB法和柱式植物RNAout试剂盒法提取的RNA 法的效果好于改良CTAB法。 本研究利用半定量RT-PCR技术，以肛aetin基因为看家基因，根据本实验室已经测序的 基因组NBS类抗病基因类似物(RGA)片段设计引物，从柱花草cDNA中扩增到目的基因。 并探讨看家基因与目的基因的最佳M92+浓度，最佳模板量和平台期循环数以及同管扩增与异 mmol／L，看家基因的最佳循 管扩增，得出结论看家基因与目的基因的最适M92+浓度均为3 环次数为28，目的基因的最适循环次数为30，并通过分组试验确定采用异管扩增。柱花草植 株分别喷施l×106个孢子／mL的炭疽菌溶液及0．01mmol／L的水杨酸溶液做半定量PCR分析， d、4d、5 以喷施蒸馏水为对照，分别提取喷施1d、2d、3 d的植株叶片RNA，按照半定量 R％PCR技术原则扩增看家基因与目的基因，比较条带的完全光密度值(IOD)。并分别提取 柱花草无菌苗的根、花、子叶、叶片中的RNA，分别扩增目的基因，结果根、花中无目的基 因表达，其余组织有该基因表达。 关键词柱花草；炭疽菌；水杨酸；总RNA提取；半定量RT-PCR U Abstract InducedResistanceandthe Stylosanthes Expression CharacteristicsofDiseaseResistanceGene