活性蛋白在聚乳羟基乙酸薄膜表面的固定化及其生物学活性的研究.pdfVIP

摘 要 聚乳酸羟基乙酸（PLGA ）由于具有可生物降解性、无毒性、良好的生物相容性和 可加工性以及优良的力学性能，被人们视为理想的组织工程材料，以 PLGA 为基材的 可降解生物材料和药物缓释载体材料成为近年来研究的热点。基于 PLGA 优良的性 能，同时鉴于生物材料易染菌的问题，本研究选择端羧基 PLGA 颗粒为基材制备得到 PLGA 薄膜，然后通过化学接枝的方法将含有氨基的活性蛋白杆菌肽和蓖麻毒素蛋白 (Ricin)分别固定化到 PLGA 薄膜表面，旨在探究活性蛋白固定化到 PLGA 薄膜上后性 能是否发生了变化，探究制备抗菌生物可降解材料和抗肿瘤药物缓释材料。本论文所 做的工作主要是： （1）以端羧基PLGA 颗粒为基材，探究了PLGA 薄膜的制备技术，制备了PLGA 薄膜，并通过全反射傅立叶转换红外（ATR-FTIR ）技术对薄膜表面的基团进行表征分 析，确定了游离羧基的存在。 （2 ）通过管碟法用本实验室所具备的四种革兰氏阳性细菌对活性蛋白杆菌肽的抗 菌性能进行初步检测，并从中筛选出抑菌效果显著的菌株-金黄色葡萄球菌作为杆菌肽 固定化到PLGA 薄膜表面的检测菌株。 （3 ）采用亲和层析的方法从去壳的蓖麻籽中提取和分离纯化蓖麻毒素蛋白 （Ricin ），通过SDS凝胶电泳对提取的Ricin 进行生化鉴定和生物学活性检测， 然后以人肝癌SMMC7721 和食道癌EC109 为实验细胞株，对Ricin 进行了抗肿瘤性能 的初步研究，比较其对不同肿瘤细胞的杀伤作用。SDS凝胶电泳结果显示提取 到的物质是纯的 Ricin ，抗肿瘤性能研究表明 Ricin 对肝癌细胞和食道癌细胞均具有很 强的杀伤作用，但对肝癌的杀伤作用强于食道癌细胞，Ricin 对肝癌 SMMC7721 的半 致死浓度 IC50 值为 5.9×10-10 mol/L ，而对食道癌 EC109 的 IC50 值为 1.984×10-6 mol/L ，这说明Ricin 对不同肿瘤细胞的杀伤作用可能具有选择性。 （4 ）对蓖麻毒蛋白的抗肿瘤机理进行初步探究，通过吉姆萨染色和吖啶橙荧光染 色对细胞进行形态学分析；采用流式细胞仪检测细胞周期的改变和细胞的凋亡情况； 提取蛋白作用后细胞的 DNA ，用琼脂糖凝胶电泳检测是否出现明显的凋亡条带(DNA Ladder) 。细胞形态学结果和流式细胞仪的检测结果均表明 Ricin 在低浓度时是通过引 I 起细胞凋亡而达到抑制细胞增殖的，而在浓度较高以及作用时间太长的时候则可能会 引发细胞的坏死。 （5 ）采用碳化二亚胺（EDC-NHS ）两步接枝法将活性蛋白杆菌肽和蓖麻毒蛋白 分别固定化到PLGA薄膜表面，通过全反射傅立叶转换红外（ATR-FTIR ）技术对固定 化后薄膜表面的基团进行表征分析；然后分别以金黄色葡萄球菌和肝癌SMMC7721来 检测活性蛋白固定化到PLGA 薄膜后的抗菌性能和抗肿瘤性能，通过MTT实验对接枝 活性蛋白前后的PLGA薄膜的性能进行比较，并辅助于吖啶橙荧光染色照片和MTT照片 对薄膜表面细菌和细胞的粘附情况进行了直观的描述。ATR-FTIR基团表征显示两种活 性蛋白都固定化到了PLGA薄膜表面上，MTT检测结果表明活性蛋白固定化到薄膜上后 仍可以发挥一定的抗菌或抗肿瘤活性。 关键词：聚乳酸羟基乙酸，蓖麻毒蛋白，杆菌肽，固定化，细胞凋亡 II ABSTRACT Poly-co-glycolic acid (PLGA) is considered as the ideal biomaterial because of its biodegradation, avirulence, biocompatibility, processa