活细胞中G蛋白联受体NTR1和APJ异源二聚化的研究.pdfVIP

活细胞中G蛋白偶联受体NTRl和APJ异源二聚化的研究 研究生：蔡欣 专业：神经生物学 导师：白波教授 中文摘要 目的 本文探讨G蛋白偶联受体(G protein—coupled 降压素受体1(Neurotensin receptor1，NTR】)和Apelin受体(putativereceptorprotein related to ATl，APJ)异源二聚体的形成，研究该异源二聚体的形成对细胞内信号转导 功能的影响。为NTRl和APJ参与的相关生理功能的细胞内分子机制提供实验依据。 试图为相关疾病发生的分子机制提供资料，本研究有助于探寻相关疾病治疗的新突破 点。 方法 umbilicalveinendothelial 1．人脐静脉内皮细胞(human cells，HUVECs)体外培养： 培养HUVECs。 chain reaction， 和蛋白质，应用逆转录一聚合酶链反应(Reversetranscription—p01ymerase RT—PCR)法和Westemblot，分别从基因水平和蛋白质水平上检测HUVECs中NTRl 和APJ内源性表达。 3．质粒构建及表达：为研究NTRl与APJ之间是否能够形成异源二聚物，我们拟 构建了相应的表达载体。首先，我们用分子克隆方法分别构建了用于BRET的两个真 和Westem 质粒构建成功的基础上，将两个重组质粒单独或共同转染HEK293细胞，进行免疫荧 光染色，并用激光共聚焦显微镜进行观察。 resonance 5．生物发光共振能量转移(bioluminescence energy 6．荧光共振能量转移(Fluorescenceresonance 信号。 7．Westem blot检测ERKl／2磷酸化：为了检测异源二聚物对受体介导的信号转导 度依赖的ERK磷酸化。 结果 1．倒置显微镜观察人脐静脉内皮细胞生长状态良好，镶嵌排列呈“铺路石”样，细 胞较大，呈多角形，无重叠生长现象。 2．通过IUPCR和Westemblot检测发现，无论在基因水平还是蛋白质水平上 NTRl和APJ在HUVECs中均有表达。 3．用于BRET和FRET所构建的质粒通过双酶切实验和上海生工测序鉴定，证实 所构建的重组质粒成功。并且激光共聚焦显微镜观察显示，受体在细胞膜表达，定位 blot显示受体表达成功，可用于进一步的实验。 正确；Westem 4．在质粒构建成功的基础上，将两个重组质粒单独或共同转染HEK293细胞，免 疫荧光染色，用激光共聚焦显微镜进行观察，结果显示：两个受体均表达在细胞膜上， 并且定位高度一致，二者存在着相互作用。 5．采用BRET技术，在活细胞中实时、动态地研究了二者之间的相互作用。饱和 BRET值逐渐增加，达到一定值的时候，BRET值不会再增加，达到饱和状态，证明 即在没有配体刺激时就能够发生。配体结合试验结果显示，用APJ的配体apelin一13 增强相互作用的亲和力。 6．我们采用另一种新的技术即FRET，研究了二者之间的相互作用。 染12-24h后，检测发现，单独转染的细胞均无FRET信号，而共同转染的细胞则有 三个实验证实，NTRl与APJ之间能够相互作用，形成异源二聚体。 5 细胞1 min，用不同浓度的(10～一1 HEK293一NTRl／APJ细胞15min。各组细胞均显示浓度依赖性的刺激ERKl／2激活。 磷酸化最强的NT浓度分别为10。7和10—8 10。mol／L。