流体剪切力影响骨髓间充质干细胞分化的机制研究.pdf

浙江大学博士论文 FSS与hMSCs成骨分化 摘要 stem 人骨麓间充质干细胞(human cells，hMSCs)是存在于骨 mesenehymal 髓基质系统中的一种组织干细胞。由于其具有多向分化潜能和低免疫原性而被 作为种子细胞广泛应用于组织工程，特别是骨组织工程。多种诱因可以诱导 hMSCs向成骨细胞分化，如激素、机械力学刺激、细胞因子等。体内骨组织中 shearstress，FSS)，这种流 的组织间隙液能对骨生成细胞产生流体剪切力(fluid 体剪切力能促进骨生成细胞的增殖和分化，对于骨骼的生长发育和正常形态功 能的维持非常重要。因此，人们在进行组织工程骨的研究过程中，利用生物反 应器模拟体内环境产生FSS作用于体外培养的hMSCs，以此促进组织工程骨的 生成。尽管已有研究证明FSS能促进hMSCs向成骨细胞分化。但是关于FSS促 进hMSCc成骨分化的机理目前还尚不完全清楚。 在本项研究中我们利用灌流培养体系产生FSS作用于接种在多孔隙 制。主要包括以下三个部分：第一部分：检测了4．2dynes／cm2间歇性FSS、4．2 hMSCs成骨分 dynes／cm2持续性FSS和0．34dynes／cm2的FSS三种不同的FSS 化的影响，并且检验了ERKl／2在FSS促进hMSCs成骨分化的过程中的作用以 况，采用改良钙钴染色和ALP活性检测试剂盒分别进行定性和定量分析不同FSS 浙江大学博士论文 FSS与hMSCs成骨分化 基因的表达和ALP活性的影响。结果表明4．2 dynes／cm2间歇性FSS能有效地促 进hMSCs向成骨细胞分化，而4．2 对hMSCs没有明显的诱导分化作用，并且4．2 dynes／crn2间歇性FSS较其他两 种FSS能更有效地提高ERKl／2的活性。同时我们的实验还证明了ERKl／2在 FSS促进hMSCs成骨分化的过程中起着重要的调节作用。 第二部分：主要验证了Bl整合素是否在FSS促进hMSCS成骨分化的过程 中充当力学受体感受力学刺激以及FSS所引起的ERKI／2活化是否通过提高 利用免疫共沉淀检测了FSS对Runx2的酪氨酸磷酸化水平的影响，并且检测了 在用小分子多肽RGDS特异性阻断pl整合素和胞外基质之间的连接后，FSS对 FAK和ERKl／2的活性的影响。最后检测在用PD98059抑制ERKl／2活性后， FSS对Runx2的磷酸化水平和p1整合素的表达的影响。结果我们发现在FSS的 达水平也显著升高。而用小分子多肽RGDS特异性阻断pl整合素后，FSS未能 ．2． 浙江大学博士论文 1=55与hMSCs成骨分化 刺激，活化的ERKl／2不仅能通过提高Runx2的转录活性而启动与成骨分化相关 的基因表达，还能反馈调节D1整合素的表达。 第三部分：在第一、二部分研究中，我们发现ERKl／2对因FSS引起的Runx2 和p1整合素表达升高具有重要的调节作用，但是ERKl／2是通过那些信号途径 来调节其表达的呢?目前还尚无相关报道。由于BMPS／Smadl／5／8信号通路是调 整合素表达的重要转录因子。我们猜测FSS引起的ERKl／2活化可能通过提高 和免疫荧光染色分别检测了FSS对NFr,B活性和核转移的影响，并且检测在用 1 BAY NFr,B的活性和核转移率显著升高，而 Smadl／5／8的升高。此外，FSS能使p65