流感病毒串联表多肽的制备及免疫原性分析.pdfVIP

摘 要 流感病毒能引起鸟类、人类和低等哺乳动物急性呼吸道传染病，由于其传播速度快、引 起并发症严重和死亡率高，给人民生命财产和国家经济发展带来灾难性打击。流感病毒结构 显示：NP和M1蛋白是病毒重要结构蛋白并在宿主选择及分型中起到决定性作用；HA蛋 白为其表面糖蛋白，在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用，是流感病毒中最重要的保护性抗 原，而且还可以刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞(cTL)反应。目前流感病毒的防控主要 是依靠疫苗进行免疫保护，但流感病毒变异迅速，传统意义的疫苗已经不能起到快速有效的 保护作用，此时基因工程亚单位疫苗体现出了巨大潜力。多表位疫苗是基因工程亚单位疫苗 的一种，是可以同时携带多个目标抗原相关表位以及辅助性表位的疫苗。它能克服主要组织 相容性复合物(MHC)分子的遗传限制，避免传统的灭活或减毒疫苗存在的生物危害性和毒力 返祖的问题。 本研究搜集已知的甲型流感病毒毒株的HA、NP、Ml的氨基酸序列，通过生物信息学 软件结合网络资源预测了其淋巴细胞表位，通过筛选获得了符合本研究需要的CTL、B、111 淋巴细胞表位，而后通过相关软件进行了构象模拟及裂解分析，设计了理论上具有疫苗功能 的多表位蛋白HMN，并将氨基酸序列对应的DNA进行合成。根据筛选的序列设计引物， 利用PcR方法扩增HMNDNA，并将其克隆至于pMDl8．T载体，在亚克隆至原核表达载体 中进行IPTG诱导表达并优化诱导条件，表达产物经sDS．PlAGE与westemBlot检测，证实 为HMN重组融合蛋白。HMN重组蛋白经镍离子金属螯合亲和层析进行纯化，纯化蛋白以 透析法进行复性折叠。利用乙肝病毒核心蛋白具有较强免疫原性的特点，将其作为疫苗佐剂 与重组蛋白HMN一同免疫小鼠，增强HMN的免疫原性。 对于本实验所构建的HMN蛋白，我们以BALB／c小鼠为实验动物模型进行了初步的免 疫学指标检测。设PBS做为空白对照，共5个组别，进行四次免疫，四免后10天杀小鼠， 眼动脉采血，制备血液淋巴细胞悬液，进行T淋巴细胞亚类计数和抗体效价检测。取免疫 器官胸腺和脾脏，进行免疫器官指数与免疫器官形态学观察。免疫斑点实验，证明多克隆抗 体效价可以达到l：12000。注射重组HMN蛋白组小鼠脾脏指数、胸腺指数明显高于对照组； 免疫组小鼠T淋巴细胞亚类计数结果显示注射重组HMN+cc蛋白组与对照组相比cD3+、 CD4+、cD8+淋巴细胞亚类的数量明显增加，且高于其他免疫组，其中cD4+和CD8+比值达 到1．5l，说明小鼠淋巴细胞活化水平相对较高，且倾向于CD4+T淋巴细胞分化，表示细胞 毒性T细胞免疫活化水平得到提高。证实重组HMN蛋白具有一定的免疫原性，为最终获得 跨种通用型流感病毒多表位疫苗进行了有意义的尝试。 关键词：甲型流感病毒，抗原表位，多表位疫苗 1 PREPARATIoNANDIMMUNoGENlCITYANALySISoF MULfTIEPIToPEPEPTIDEoFINFLUENZAVIRUS XuJun SuperVisor：Prof MasterCandidate：Ma Qian ABSTRACT Influenza aIl VimsescaIlcauseacute infectiousdiseasetobirds，humans respiratory 觚d觚imals．Becauseofits and serious Speedcausing complications锄dhigll disastrousblowto liVesand andnational mortali劬whichc卸bring people’s property structureofinfluenzaVirus