深海热液区非培微生物基因资源的功能选及研究.pdfVIP

摘要 摘要 深海热液区具有高温、高压、剧烈化学梯度和pH梯度等特征，属于地球上 最极端的环境，其中蕴含着丰富独特的微生物资源。这些微生物在长期的环境适 应过程中形成了自身独特的代谢机制，可能产生一些比较特殊的次级代谢产物， 非常有助于对海洋天然药物和新颖生物活性分子的开发利用。 分子生态学研究发现，绝大部分的海洋微生物是不可培养的，仅有极少数的 微生物能够被分离鉴定出来。采用宏基因组学技术，能够获得自然环境中所有可 培养微生物和不可培养微生物的全部基因。它能够克服纯培养的局限性，有利于 深海热液区微生物基因资源的研究。 本文对7个宏基因组文库共计26600个克隆子进行了抗细菌、抗真菌、抗肿 瘤等活性筛选。 以枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示细菌，采用双层琼脂平板法从 个活性克隆，从Fosmid文库3．11．8中筛选到3个活性克隆，筛选活性克隆分别 占它们各自文库克隆的0．0635％，0．153％，O．15％。 以酿酒酵母和白色念珠菌作为指示真菌，采用滤纸片琼脂扩散法对上述15 个活性克隆进行抑菌实验，发现其中9个克隆子具有抗真菌活性。 以HTl080和BEL7402肿瘤细胞系为筛选模型，采用CCK．8法对上述9个 产色素活性克隆子进行筛选，发现其中3个克隆子具有较好的细胞毒性。 在对文库进行活性克隆筛选的过程中，意外地发现一些活性克隆子能够产生 色素。本文选取了其中5个产色素较为稳定的活性克隆子进行转座突变，结果发 现转座突变使编码sigma54-依赖性转录调控因子或苯酚羟化酶的功能基因失活 后，会导致色素缺失现象。 以金黄色葡萄球菌为指示菌，对活性克隆子25D7的色素缺失突变子进行抑 菌试验，发现色素缺失突变子的生物活性消失。在文库克隆筛选中，色素可作为 ～个初步的筛选标记，有利于快速判断外源基因是否在宿主体内获得表达。 子的抗肿瘤细胞活性筛选，从中分别筛选到6个活性混合克隆子和1个活性混合 ——————————————————————羔堕L——————一一 克隆子，这些混合克隆子具有一定的细胞毒性。 研究发现，滤纸片琼脂扩散法和双层琼脂平板法相结合，对文库进行高通量 筛选，可以有效避免出现活性克隆假阳性和漏筛；文库构建前，对样品进行放线 菌和真菌等的富集，有助于提高筛选效率。 关键词：深海热液区；宏基因组文库；转座突变；功能筛选 Ⅱ Abstract on mostextremeenvironmentse酬【n， the vents，among hydrothermal Deep．sea chemical gradients，pH the pressure，sharp ch跚．acterizedhightemperature，high arc by orderto to of adapt lots microorganisms·In andSO special gradientson，containing formthemself extremeenvironments，thesemiroorganisms uni