水稻系统获得抗基因OsSRT2的克隆及功能分析.pdfVIP

万方数据 摘要 人们通过基因工程技术发掘了一批拥有一定针对性的抗病基因，这些基因可以 作为一个复杂的基因防御体系保护水稻植株免于细菌、真菌、病毒以及线虫病原菌 的侵染。抗病基因在植物体内编码的产物可以特异性地识别不相容的病原体，引发 SA 一系列级联反应，导致宿主发生抗病反应。一种小分子的植物激素—水杨酸（ ） 在植物抗病过程中扮演着重要的作用。病原体应答性的水杨酸生物合成被认为是受 到PAD4、EDS5 以及SID2控制的。而PAD4、EDS5、SID2 的病原诱导表达在拟南 AtSRT2 , AtSRT2 SA 芥中会被 抑制说明 在调节 合成方面有重要作用。水稻中含有 AtSRT2 的同源基因—OsSRT2，它们都属于沉默信息调节因子2 （Silentinformation regulator2，Sir2）蛋白。Sir2 自首次在酵母中被克隆出来以来，其同源物在一些哺 乳动物中被相继被克隆，然而我们对植物中Sir2家族的作用却知之甚少。 为了探究Sir2类型蛋白在水稻系统获得抗性中所扮演的角色，我们研究了 OsSRT2的亚细胞定位情况；转基因植株中的基因表达量及其与抗性诱导相关水杨 酸含量的关系；转基因植株对白叶枯病病菌的抗性情况等。具体如下： 1．从水稻日本晴cDNA 中克隆出SAR信号途径的关键基因OsSRT2，序列分析 显示该其基因 cDNA 的全长为938 bp 的OsSRT2 基因编码的蛋白质分子量 Mw=34.56kD，等电点pI=8.76。与NCBI 已登录的水稻SRT2基因同源性为99%， 蛋白质序列同源性100%，说明SRT2在物种进化过程中核苷酸发生了同义突变，而 蛋白质水平的进化较保守。 2 为了发现OsSRT2基因的作用部位，推测OsSRT2作用方式提供依据。通过 基因枪，瞬时转化35S-OsSRT2-GFP融合表达质粒到洋葱表皮细胞，在荧光显微镜 下检测亚细胞定位情况，结果可见OsSRT2定位于细胞核内。 3构建了OsSRT2的过量表达载体和RNAi 干涉载体，通过农杆菌转化技术导 入水稻内，共记获得9株T 代过表达阳性植株，8株T 代干涉阳性植株。对获得1 1 的转基因植株T 代体内游离态水杨酸 （SA）含量进行HPLC测定，OsSRT2过表达1 植株体内水杨酸的含量明显低于对照；而OsSRT2RNAi植株体内自由态水杨酸的含 量大约是对照的1.5倍。说明OsSRT2参与调节SA在植株体内的积累，抑制植株体 内的SA含量，从而间接证明了OsSRT2参与SA介导的抗病信号过程。 4 对转基因植株中目的基因的水杨酸诱导表达模式进行了分析，结果显示，过 表达植株中OsSRT2的含量高于野生型两倍多，在SA处理后有一定下降，但依旧 维持在较高的水平。而干涉植株的OsSRT2的含量大约为野生型的1/2，在SA处理 后也有一定下降，处于一个较低的表达水平。 5 在剑叶期分别对OsSRT2过表达，OsSRT2-RNAi及野生型的日本晴植株进行 白叶枯病病原菌接种鉴定，结果显示：OsSRT2-RNAi 的抗病能力明显提高，而 I 万方数据 OsSRT2过表达转基因水稻水稻更易感病。 上述表明克隆的OsSRT2基因通过负调控作用与水稻的抗病性相关。系统获得 性抗性 （SAR）是植物抗病体系的一种重要的组成部分，而SRT2类基因也是SAR 系统中的主要作用基因，因此，成功获得OsSRT2基因并进行相关研究，不仅揭示 了OsSRT2的作用方式和在抗病通路中扮演的角色而且提供对转基因水稻抗虫品种, 有使用