烟草WRKY-ike基因的克隆与功能初探.pdfVIP

摘要 烟碱是烟草特有的根系合成的次生代谢产物。在烟草生产中，烟株打项后，烟碱含量急剧 增加。有报道认为，打顶后烟碱合成能力增强可能是由于伤害刺激或者是植株激素源发生变化和 根系的二次发育引起的。为探究烟株打项后，烟碱含量增加的调控机制，本实验室建立了 转录因子作为研究对象，克隆了该基因并通过瞬时表达初步探讨了其对下游基因的调控作用。主 一 要结果如下： 一、wRKY-like转录因子的克隆与生物信息学分析 朋翮肛月y。序列分析显示其开放性阅读框架为915bp，编码304个氨基酸。 2．与不同植物中的wRKY转录因子基因序列比对结果显示，肋肠嗽z彤具有wRKY转录因 子家族典型的保守结构域WRKYGQK与一个C2H2型的锌指结构域和一个核定位信号；聚类结果 归属于懈Y家族的第1I类；磷酸化位点分析该蛋白多肽链中有22个磷酸化位点。朋肠眦弘肜 含有两个内含子，均有典型的剪接特征“GU—AG”结构，且内含子1为R型内含子。 二．^谚凇幻2尼，转录因子的表达特性分析 1．R1’-PCR分析显示朋翮肥厅／在烟草根、茎和叶中均表达，但在根中的表达水平显著高于 其它组织。 2．Nonllem杂交分析打顶前、后根尖组织肋凇彤K牙／结果显示，烟株打顶后肋历暾耳肼表 达水平明显降低。 后2·4m腮麟忍，表达量下降，在6h时升高，10h．24h表达量下降，且较打顶前下调。 三．朋励隧弘肼转录因子的表达载体构建和瞬时表达分析一 构建过表达载体PROK2．朋嬲膨詹，转化烟草原生质体进行瞬时表达分析。结果表明：烟草 朋翮肛尼，抑制JA依赖信号途径和激活sA依赖信号途径，且负调控乃讶7y的表达。 四．克隆烟草，M仍基因的启动子并进行生物信息学分析 采用RT-PcR从烟草根尖组织中克隆到烟草P4仍基因的启动子，并对其顺式作用元件进行 了分析，脚基因的启动子中含有3个与wRKY转录因子家族结合的w-box元件和多个响应激 素的顺式作用元件。 以上实验结果表明，烟草朋嬲髟一尼，转录因子参与打顶后的JA和SA等多种激素信号途 径；肋励嗷只彤基因负调控烟草脚基因的表达，且烟草删基因的启动子中含有多个wRKY 转录因子结合的w-box结合区域。推测烟碱的生物合成调节机制与朋腑肛肜参与的激素途径 有关。这些结果为后续深入研究肋腑髟玲肼转录因子对地上部打顶伤害的响应及与打顶后烟碱 生物合成能力增强的关系奠定了基础。 关键词； 烟草；打顶；功能分析；次生代谢；愀Y转录因子；根系 2 AhtI薯ct Nico廿neisthe inthe oftobaccoroot—ln诖le seconda珂metabolitesyntllesis lHlique oftobacco ofnicotineintobacco洒creasedafter period pmduction，content dramatically are that也e me ofnicotine topping．Therereports reason讪y synmesis ability sn-engⅡ1ens bedueto orthe of hornlonesor廿le of may damagechangeplanteIldogenous development theroot．For t11ereason contentincreasedandme mechanism stIldying why廿1e r