玉米GLTR和SAT的大肠杆菌重组表达及活性研究.pdfVIP

摘 要 5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid ，ALA)是高等植物四吡咯分子如血红素和叶 绿素合成的第一个调节位点。ALA 的合成由谷氨酰-tRNA 还原酶（glutamyl-tRNA reductase ，GLTR ）和谷氨酸- 1- 半醛氨基转移酶 (glutamate- 1-semialdehyde aminotransferase，GSAT)催化。ALA 在细胞中被转化成尿卟啉原 III，它被尿卟啉原 III 甲基化酶转化成荧光化合物，重组大肠杆菌细胞的荧光和细胞内ALA 产量呈正相 关。已报道，GSAT 结合硫氧还蛋白，它在氧化还原信号传导中起重要作用。玉米叶 肉细胞和维管束鞘细胞这两个蛋白的分布存在明显差异，但其调节机制尚不清楚。目 前, 尚无这两个酶的活性研究报道，本文初步研究了玉米 GLTR （maize GLTR ， mGLTR ）、GSAT(maize GSAT, mGSAT) 以及mGSAT 突变体（mGSATM ）在大肠杆菌 的重组表达和纯化,建立了利用大肠杆菌为宿主检测重组表达这两个酶活性，以及抑 制剂对mGSAT 活性影响的新型技术体系。获得以下主要结果： 1. 重组蛋白的表达和纯化：RT-PCR扩增成熟mGLTR和mGSAT 的编码基因，分 别插入表达载体p28SUMO ，0.5 mmol/L的IPTG，28°C诱导12 h，表达的靶蛋白N端融 合小泛素相关修饰蛋白(SUMO)标签，Ni-NTA一步亲和纯化融合蛋白，SUMO水解酶 ULP 除去SUMO标签，SDS显示纯化的mGLTR和mGSAT各为一条主带，亚基分 子量分别约50 kD和43 kD左右。 2. 重组mGLTR的胞内活性测定：大肠杆菌共表达ULP和含有SUMO-mGLTR融合 蛋白，SDS显示ULP在细胞内能有效切割SUMO-mGLTR, 胞内ALA含量为2.74 μM/OD600 ，而对照为1.60 μM/OD600 。共表达ULP 、SUMO-mGLTR和尿卟啉原III 甲基 化酶，重组菌的红色荧光蛋白在激发光357 nm、发射光620 nm处显示的荧光值为6.69， 而对照为5.26 。表明重组mGLTR在大肠杆菌细胞中具有催化活性。 3. 重组mGSAT及其突变体的胞内活性测定：大肠杆菌共表达ULP 、大肠杆菌 GLTR和含有SUMO标签的mGSAT(或mGSATM) ，SDS显示ULP在细胞内能有效 切割SUMO-mGSAT, 胞内ALA含量为6.02 μM/OD600(或6.42 μM/OD600)，而对照为1.39 μM/OD600 。共表达ULP 、EcGLTR、含有SUMO标签的mGSAT和尿卟啉原III 甲基化酶， 重组菌的红色荧光蛋白在激发光357 nm、发射光620 nm处显示的荧光值为7.35，而对 照为4.93 。表明重组mGSAT及其突变体在大肠杆菌细胞中具有催化活性。 4. 纯化的mGSAT蛋白性质检测：将纯化得到的mGSAT进行紫外可见光谱扫描， 结果显示有337 nm和410 nm两个光吸收峰，表明mGSAT蛋白结合辅酶磷酸吡哆胺。 纯化的mGSAT结合固定化的重组玉米硫氧还蛋白（thioredoxin ，Trx）突变体，并能 被还原剂巯基乙醇剥离，SDS检测到mGSAT条带，表明mGSAT和Trx有相互作 用。 I 综上所述，本文克隆了玉米成熟mGLTR和mGSAT的编码基因，分析了它们在大 肠杆菌中的表达性质，亲和纯化获得了重组蛋白，建立了重组mGLTR和mGSAT在大 肠杆菌细胞内催化活性的检测方法，初步分析了体外mGSAT与Trx突变体的相互作 用。由于人和哺乳动物中不含有这两个酶，该系统在筛选基于靶向GLTR和/或GSAT 的安全除草剂和杀菌剂，以及在大肠杆菌中生产一些野生型难以表达的异源二体具有 潜在应用。 关键词：谷氨酰tRNA还原酶，谷氨酸半醛氨基转移酶，玉米，5-氨基酮戊酸， 共表达，大肠杆菌，小泛素相关修饰蛋白(SUMO) II Ab