玉米丝氨酸消旋的重组表达、纯化及其酶学性质研究.pdfVIP

摘要 丝氨酸消旋酶 （serine racemase，SR）是一个双功能酶，同时具有消旋酶和脱水 酶活性，可以将L-/D-丝氨酸转化成相应的D-/L-丝氨酸；还可以将L-/D-丝氨酸转化成 丙酮酸。已研究了拟南芥、大麦和水稻SR的酶学性质，但是重组蛋白的C端都含有组 氨酸标签。在数种植物中，玉米对外源D-丝氨酸的耐受性最高，但其分子机制尚不清 楚，为此，本文研究了不同标签对重组玉米SR的各种活性的影响，分析了重组蛋白 转化D-丝氨酸的活性，尝试利用玉米SR作为筛选标记转化烟草，获得如下结果： 1. 克隆并分析了玉米丝氨酸消旋酶编码基因。从NCBI 中搜索到与大麦SR高度同 源的玉米SR预测基因NM_001143028.1 ，利用RT-PCR的方法，从玉米幼叶中克隆该编 码基因。从核苷酸序列推定的氨基酸序列比对显示玉米基因编码与登陆的不同植物 SR，包括大麦（BAF63026.1 ），水稻（NP_001053521.1 ），高粱（AAT42169.1 ）和拟 南芥（XP_002872605.1 ）的相似性分别为87%，91%，94%和69%，表明它与禾本科 单子叶植物SR的同源性高，与拟南芥同源性低。 2. 表达和纯化了玉米SR。不同表达载体中的诱导表达结果显示，SR编码基因插 入pET28-TEV中，诱导表达His-SR后，TEV酶切除His-tag标签的效果最好。纯化的 His-SR和SR亚基分子量分别为38 kDa和36 kDa 。蛋白的表达量分别为2.5 mg/ml和1.93 mg/ml 。 3. 带标签和不带标签玉米SR的活性分析。结果表明，无标签的SR活性最高。C 端His-tag明显降低脱水酶活性，但对消旋酶活性抑制较小；N 端His-tag对丝氨酸消旋 酶活性和脱水酶活性比N 端标签的抑制效果不明显。 4. 分析了SR的脱水酶酶学性质。反应的最适温度是37℃，最适pH为8.8，在Mn2+ 存在的条件下活性最大 SR的Km 值是12.5 mM ，Vmax 值是8.4 nmol/min/mg。 5. SR作为筛选标记转化烟草。在含有10 mM D-丝氨酸的选择培养基上进行筛选， 初步获得了转基因烟草，PCR检测结果呈阳性，表明SR可以作为一种无抗性选择标记。 综上所述，本研究克隆了编码玉米SR的基因，研究了不同标签下重组SR的多种 活性，分析了SR的脱水酶性质，发现组氨酸标签对酶的活性有一定影响。另外，尝 试利用SR作为筛选标记转化烟草，初步获得转基因植株。 关键词：玉米丝氨酸消旋酶，重组表达，标签，酶活性，无抗性选择标记 I Abstract Serine racemase (SR) is a bifunctional enzyme which catalyzes not only serine (L-serine, D-serine) racemization but also dehydration of L-serine and D-serine to pyruvate. The enzymatic properties of SRs have been studied in the Arabidopsis, barley and rice, while the recombinant proteins contain C -terminal histidine tag.Serine racemase could degrade D-serine. Zea mays had a higher tolerance on the D-serine than other plants. No mechanism for the toxicity has yet been proposed.In this study, different labels on a variety of recombinant maize activity of SR were analyzed. Enzymatic characterizations of recombin