硫霉素生物合成因簇的异源表达及其改造.pdf

摘要 Y1 摘 要 碳青霉烯类抗生素(c曲印enems)是一种非典型B．内酰胺抗生素，起源于上 世纪八十年代。因为其抗菌谱广，抗菌活性较强而得到广泛应用。 碳青霉烯类抗生素对革兰氏阳性菌以及多重耐药或产B．内酰胺酶的细菌均 有很强的抗菌活性。碳青霉烯类抗生素可以通过孔道结合所有种类的青霉素结合 amibi砸c 蛋白(penicillinbillmngprote缸，PBPs)并具有持续的抗生素后效应(poSt e彘Ct’PAE)。与其它内酰胺类抗生素相比，临床主要致病菌对碳青霉烯类的耐药 明显低于其他抗生素。因此，耐受性好，副作用小的碳青霉烯类抗生素已成为当 前治疗院内严重感染等疾病的首选药物。 碳青霉烯类抗生素是由青霉素结构改造而成的，它的结构特征是B．内酰胺 环与另一个二氢吡咯环并在一起，这种结构综合了青霉素的青霉烷环和头孢菌素 的共轭双键活化的双重作用。碳青霉烯类抗生素使用亚甲基取代了硫原子，由于 亚甲基的夹角比硫原子小，加之C．2与c．3间的双键存在使二氢吡咯环成一个平面 结构，从而导致了硫霉素不太稳定，也给分离纯化带来了困难。由于种种原因， 硫霉素未能在临床中应用。 第一个碳青霉烯类抗生素沙纳霉素(也ien锄哆cill)又称硫霉素，是由美国默克 公司从淡紫色链霉菌砌印幻，缈卯∞脚伽发酵液中分离得到的。1985年，亚胺 培南作为第一个碳青霉烯抗生素在日本得到使用，其商品名为泰能(Tienam)。因其 极强的抗菌活性在治疗中发挥了极其重要的作用，市场前景良好。 mediated 重组工程(Re扼T∞combillationgeneticenginee血g)是指在重组酶 的催化下进行的DNA片段之间的同源重组并藉此达到在大肠杆菌中进行基因克 隆或改造的一种技术。重组工程的优点在于可以不受酶切位点的限制在基因片段 的任意位点进行准确的敲入、敲除、置换，现已逐渐成为取代常规方法的一种新 型克隆手段。 重组工程中的重组酶主要是来源自噬菌体三个基因，其中邝d(册)基因编码 外切酶，具有5’端的外切酶活性并能作用于双链DNA分子使其产生3。端突出的 分子；陀d(6PD基因可以编码单链结合蛋白，同时还具有重组酶活性；陀d乜册) 基因则能抑制大肠杆菌RecBCD对外源DNA的降解，维持重组系统的稳定性。 本课题旨在通过ET同源重组对硫霉素生物合成基因簇进行改造，将强启动 子序列em】却幸整合到硫霉素生物合成基因簇中，期望能高效启动硫霉素的生物 Zfvf出瑚．K4中异源表达。 合成，并能在变铅青链霉菌勋印fD唧雠s 自20世纪80年代以来，随着癌症的发病人数成上升趋势，世界抗癌药物市 摘要 场迅速成长，其销售增额迅速超过了其他类药物。仅国内每年新增癌症患者约就 160万人，而接受治疗的人数达200万左右。阿霉素和柔红霉素为葸环类抗生素， 同时也是联合国世界卫生组织(WHO)推荐的治疗肿瘤化疗的基本药物。 该课题将构建阿霉素表达质粒异源表达阿霉素，希望可以利用微生物发酵的 方法生产阿霉素，这样就可以简化生产工艺，降低成本，减少污染，具有巨大社 会效益和经济效益。 关键词：硫霉素，同源重组，异源表达，阿霉素 Ⅱ Absl舱ct AbStraCt inmelate80sand p—lactam鲫：ti：1)io乱s， Ori蛳ed daSSi矗ed硒然憎ical abroad of