精卵发生特异性录因子SOHLH1的DNA结合序列分析研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 分析研究 刖 再 生殖细胞的发生是一个极其复杂又特异的过程，既有体细胞的有丝分裂还有 其独特的减数分裂过程，因而在睾丸或卵巢中必然存在一些特异基因，直接或间 接地调控生殖细胞的发生。这些特异基因在生殖细胞不同的发生阶段的表达与调 and basic factor，精卵发生特异碱 oogenesisspecifichelix-loop-helix(bHLH)transcription 性螺旋环螺旋转录因子)基因是近年来从睾丸和卵巢中发现的一个特异基因，研 究已证实它编码一个生殖细胞特异性转录因子，在精子和卵子的发生过程中起着 重要的调节作用。本研究运用分子生物学基本技术，扩增目的序列，构建 pGEX．SOHLHl融合表达质粒，并运用IPTG诱导目的蛋白表达。通过纯化包涵体， Bind 对包涵体内蛋白透析复性，用GST Resin亲和层析纯化获得重组蛋白。最后 运用靶序列循环扩增(The of CyclicAmplificationSequence 验来确定SOHLHl的DNA结合序列。对生殖细胞特异转录因子sohlhlDNA结合 序列的分析为进一步研究精卵发生中SOHLHl的表达调控和后续精卵发生中的基 因表达调控过程奠定基础。另一方面还为我们对精原卵原细胞早期分化过程进行 人为干扰提供了选择，通过人为的干扰可以获得一些不孕不育的动物模型，从而 为生殖医学技术的发展提供新的研究思路。 方 法 本实验通过PCR的方法，扩增并回收SOHLHl蛋白中螺旋环螺旋结构域基 因序列，将目的片段插入到原核表达质粒pGEX．4T-2的GST基因下游，构建 鉴定及DNA测序筛选正确的融合表达载体。通过在不同温度、不同IPTG终浓度 及不同诱导时间条件下对诱导菌体聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的分析，得出最佳诱 导条件。在最适条件下对菌体进行诱导，经裂解、透析复性得到溶解蛋白，该蛋 Bind 白经GST Western 实验得到的PCR产物的序列，得出SOHLHl蛋白的DNA结合序列。 结 果 DNA测序证实目的片段成功插入到表达载体中。 表达量最高，GST-SOHLHl融合蛋白分子量约为36KDa。 3、GST-SOHLHl蛋白以包涵体形式存在，经裂解、透析复性得到溶解蛋白， Bind 该蛋白经GST Resin亲和层析，获取纯化后的GST-SOHLHl蛋白。 结论 1、成功构建插入小鼠SOHLHl蛋白螺旋环螺旋结构域基因序列的重组原核 表达质粒pGEX．SOHLHl。 ACTT／G／C 2、经CAST实验证明DNA序列G A可能为转录因子SOHLHl 的特异结合序列。 关键词 SOHLHl；转录因子；HLH；DNA结合序列 2 ● 英文论著摘要 and onDNA of AnalysisStudy BindingSequence and SpermatogenesisOogenesis SpecificTranscription Factor SOHLHl Introduction Theoccurren