人羊水和血浆蛋质组的差异性分析.pdfVIP

人羊水和血浆蛋白质组的差异性分析 硕士研究生：宋萍萍 指导教师：辛 毅 教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘 要 羊水栓塞是羊水进入母体血液循环后引起的极严重的分娩期并发 症，其有关发生率的文献报道并不一致，为1：5000～1：80000。足 月妊娠时死亡率高达70．80％，其诊断主要依据多样复杂的临床表现。目 前对羊水栓塞等多种妊娠相关疾病的早期检测仍缺少公认的标准，而且 现在使用的标记物有不充分的个体检测率和特异性，因此需要开发多种 生物标记，进一步寻找更为特异性的标记物。 对于来源于不同组织或者不同生理状态下的蛋白质样品间的比较， 是用于鉴定某种疾病的生物标记的可能性之一。目前蛋白组学分析已被 广泛用于体液的研究中，许多研究组采用不同的技术方法，使用不同的 蛋白质数据库，而且鉴定蛋白质的严密水平也是不同的，对此我们很难 去评价每个蛋白质数据库的准确性，但采用不同技术路线所获得的结果 是可以互相印证和补充的。 实验目的： 通过载体两性电解质2．DE和MALDI．TOF质谱等蛋白质组学技术对 正常人羊水和血浆进行比较，希望在羊水中发现一些特异表达的蛋白质 标记物，从而能早期诊断羊水栓塞等妊娠相关疾病。可以说，羊水中某 些蛋白质的表达是很有意义的，它们反映了妊娠期生理上和病理上的状 况，因此羊水的蛋白质组学分析对阐明妊娠期机体病理变化来说，是理 想的第一步，这也将有助于我们发现某些妊娠疾病的早期诊断性标志物。 实验方法： 1．样品的制备：羊膜腔穿刺法采集12份正常妊娠(16．18周)孕妇 的羊水以及肘部静脉穿刺采集12份正常人血浆，然后离心取上清，冷冻 blue 干燥以利于保存。2．样品的处理：本研究所采用的是基于Cibacron F3GA填料的亲和层析吸附自蛋白的方法，以去除体液中的第一大高丰 度蛋白，即白蛋白。3．2．DE：采用载体两性电解质pH梯度等电聚焦为第 一向的双向电泳(ISO．2DE)和与质谱兼容的银染技术，观察正常人羊 水和血浆样品两者间的蛋白表达情况。4．凝胶图像的分析：载体两性电 解质的等电聚焦双向电泳凝胶，通过Canon5．0数码相机获取图像，再 8．0软件分析完成差异分析。在羊水组和血浆组之间进行 利用PDQquest 斑点检测和匹配，从而在羊水组中找到差异性蛋白点。5．银染胶内酶解 肽段的提取：扣取特异性蛋白点；然后进行酶解并提取肽段。6．肽指纹 搜索并鉴定可能的相应蛋白。7．确定差异蛋白质：通过Western Blotting 技术，再次验证羊水中的差异性蛋白是否只存在于羊水中，而并不存在 于血浆中。 实验结果： 1．本实验采用的是基于Cibacron blue填料亲和层析吸附白蛋白的方 法，SDS．PAGE的结果可见羊水和血浆中的大部分白蛋白(Mw66ku)已被 去除，蛋白条带较去除前明显清晰。 2．应用载体两性电解质2-DE分离羊水和血浆中的蛋白质，其结果显 示，羊水约102个蛋白点，血浆约l47个蛋白点。 8．0软件完成差异分析，其中在羊水中发现4个差 3．利用PDQquest 异蛋白点。 结果是，羊水中四个差异蛋白点，分别是ZAP．70、T．Box 3、IKK．B和 KIAA1 145。 5．为确定这些差异蛋白， 我们通过考马斯亮蓝定量和 3蛋白进行分 Western．Blotting方法来验证。本实验只对IKK—B和T·Box 析，结果发现在血浆中也均存在这两种蛋白质，其中血浆中IKK．B含量 并不低，与羊水中含量并无明显差异，而羊水中T．Box3蛋白的含量是 高于血浆的