嗜热厌氧乙醇杆木糖转运和代谢系统的分子重组研究.pdfVIP

摘要 摘要 生物乙醇作为一种清洁的可再生能源被多数国家纳入发展战略规划。廉价的 原料是燃料乙醇工业化生产的必要条件，利用可再生植物纤维资源制取乙醇成为 当前的研究热点。木糖是木质纤维素水解产物中含量仅次于葡萄糖的单糖，将木 糖发酵生成乙醇，可提高纤维素转化乙醇的效率，从而降低生产成本，促进燃料 乙醇生产工业化。迄今发现的微生物或构建的工程菌株，木糖发酵乙醇的生产性 能仍然不能达到工业化生产的要求，因此，筛选性能优良的木糖发酵菌株和研究 微生物木糖代谢工程成为该领域的研究重点。 · ethanolicus 本文主要研究内容是从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ● 丁W200)基因组DNA中克隆木糖转运和代谢相关基因，并对相应操纵子进行序 列分析；对木糖异构酶进行表达纯化及酶学性质的分析；利用Red重组方法将 木糖转运及代谢操纵子整合到大肠杆菌基因组，研究重组菌株利用木糖的能力。 1．从嗜热厌氧乙醇杆菌基因组中克隆了包括木糖转运操纵子在内的9个基 木糖转运操纵子的转录调控序列进行了分析。 2．构建了携带木糖转运操纵子的整合质粒，利用RED重组系统，将嗜热厌 氧乙醇杆菌来源的木糖转运操纵子整合到大肠杆菌基因组D型乳酸脱氢酶位点， 同时敲除D型乳酸脱氢酶基因，获得了整合菌株五coli 合茵枢coli coli 长，而且生长趋势比野生型菌株E K12要好。 3．从嗜热厌氧乙醇杆菌基因组中克隆了木糖代谢操纵子(删坳)以及上游 很大的差异性：并对木糖代谢操纵子的转录调控序列进行了分析。 4．在大肠杆菌中成功表达了木糖异构酶(XylA)，通过热处理和阴离子交 换柱两步纯化后，酶纯度达到电泳均一。纯化的XylA最适反应温度为85℃，最 h半衰期温度为85℃。当 适pH为7．0，在pH乱10之间有良较好的稳定性，1 时，c02+和M矿对其活性有很大的激活作用。以D．木糖为底物，XylA的米氏常 数‰为11 mM，酶促最大反应速率％嚣为25U／rag。 摘要 5．构建了携带木糖代谢操纵子的整合质粒，利用Red重组系统，以E．coli K12(A 得了整合菌株Ecoli coli 微弱生长。 关键词：嗜热厌氧乙醇杆菌；大肠杆菌；木糖转运；木糖代谢；Red重组；木糖 异构酶 Ⅱ Abstract ● Abstract Bioethanolistaken acc,ountaLs as into asustainable， manystates’strategy andrenewable rawmaterialisneededforcommercial portable energysource．Cheap fuel—ethanol theutilizationofabundantandrenewable production；therefore could makebioethanolmore