几种重要海水养鱼类细胞系的建立、诱导分化及其应用研究.pdfVIP

几种重要海水养殖鱼类细胞系的建立、诱导分化以及应用研究 几种重要海水养殖鱼类细胞系的建立、诱导分化及其应用研 究 摘 要 鱼类细胞系的建立始于上世纪60年代，由Wolf和Quimby建立了世界上第 一个鱼类细胞系．虹鳟生殖腺细胞系RTG．2。随后，鱼类细胞培养工作取得了较 大的进展，一些细胞系相继建立成功。鱼类细胞系因材料容易获得、成本低、重 复性好、实验条件可以精确控制等优点，至今已成为一种重要的研究手段，广泛 应用于鱼类病毒学等各方面研究。对鱼类细胞系进行深入研究无论在理论研究方 面还是在实际应用方面都具有深远意义。 本论文研究了半滑舌鳎(Cynoglossus 圆斑星鲽(Verasper 鳎胚胎细胞系(HEC)和日本牙鲆(Paralichthys 进行了干细胞功能的诱导分化；并将大菱鲆胚胎细胞(TEC)应用于大菱鲆 GRIMl9基因的功能研究工作上。半滑舌鳎心肌细胞系和圆斑星鲽肾脏细胞培养 在添加有20％FBS，1mM的L．谷氨酸，50mM的2一ME，100UI／ml青霉素， 100 bFGF的MEM培养基中，两种细胞的形态均为成纤 u幽m链霉素，10n幽：nl 内，细胞生长速度随FBS浓度的增高而加快，FBS浓度过高或过低都抑制细胞 ℃之间细胞生长良好，当温度高于30℃或低于12℃时，细胞生长速度降低。HTHC 胞中并获得了表达，转化率为10．15％左右。用牙鲆淋巴囊肿病毒(LCVD)感 胞内发现了大量病毒颗粒。 半滑舌鳎胚胎细胞系(HEC)和日本牙鲆胚胎细胞系(FEC)为本实验室建 I 几种重要海水养殖鱼类细胞系的建立、诱导分化以及应用研究 立保存。HEC和FEC都具有发育上的多能性，在特定的诱导条件下，都可以诱 导分化为纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞等各种类型的细胞。全反式视黄酸(RA)、 明胶、低浓度FBS均可以诱导两种胚胎细胞分化为纤维细胞；二甲基亚砜和低 密度种植HEC细胞均可以诱导髓C细胞分化为树状肌肉细胞；HEC和FEC细 胞在低密度条件下均分化为神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞；HEC和FEC细胞 碱性磷酸酶染色均呈阳性，这些结果初步表明HEC和FEC胚胎细胞具有干细胞 和FEC细胞，观察到了细胞病变效应(CPE)，通过透射电镜观察到在细胞内有 大量病毒颗粒。 我们从大菱鲆脾脏cDNA文库中鉴定出一GRIMl9基因，并得到该基因的 DNA全长。利用RT-PCR技术对该基因进行了在大菱鲆正常组织、不同胚胎发 育阶段、鳗弧菌(Vibrio 初步探讨了GRIMl9基因在鱼类先天免疫系统中作用。实验结果表明：GRIMl9 reading 通过比较cDNA序列和基因组序列发现GRIMl9基因内含有5个外显子和4个 内含子。基因组Southern结果表明该基因为单拷贝基因。系统发生分析表明大 菱鲆能够与大西洋庸鲽聚在一起。该基因在正常大菱鲆免疫系统中表达强烈，尤 其是在脾脏和头肾中；GRIMl9在大菱鲆胚胎不同发育时期表达逐渐增强；在感 染头肾、肝脏、脾脏三种组织中，该基因表达均有增加趋势：在感染头肾中该基 因表达最强烈，在肝脏感染24h时基因表达达到最高水平，而在脾脏中该基因表 达一直增强：鳗弧菌感染大菱鲆胚胎细胞后，删19基因表达上调。GRIMl9 基因在濒临死亡的大菱鲆成体鱼肝脏、头肾、心脏和脾脏中的表达均增强。这些 结果表明GRIMl9基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。 关键词：体细胞系，胚胎细胞系，诱导分化，病毒感染 几种重要海水养殖鱼类细胞系的建立、诱导分化以及应用研究 ■ ■ II ■ - ■ of II I l I naUCementancl Establ-shmentce neS．