利用PCR和环导等温核酸扩增技术(LAMP)从野生褐家鼠和屋顶鼠中检测路氏锥虫(Trypanosoma lewisi).pdfVIP

利用PCR和环介导等温核酸扩增 技术(LAMP)从野生褐家鼠和屋顶鼠中检测路氏锥 lewist) 虫(Trypanosoma 专业：微生物学 硕士生：唐海军 指导老师：伦照荣教授 摘要 路氏锥虫(TrypanosomalewisO是一种血液鞭毛虫，主要的中间宿主是褐家 鼠(Rattus norvegicus)和屋顶鼠(Rattusrattus)，通过跳蚤传播，呈全球性分布。 长期以来，人们普遍认为路氏锥虫是一种宿主特异性极强的非致病性原虫。但是， 这一观念目前正在受到挑战，因为人感染路氏锥虫的病例被陆续报道，且病人有 明显的临床症状。路氏锥虫作为一种新的人兽共患病原体己引起世界卫生组织 Health (World Organization)的重视。 目前检测路氏锥虫的方法主要是病原学检查，取血液涂片观察到虫体即可确 诊。病原学检测准确率高，为诊断的金标准，但该法不便于大规模筛查，且灵敏 度较低。因此，发展一种新的检测路氏锥虫的方法显得尤为重要。环介导等温核 isothermal 酸扩增技术(Loop．mediated 高特异性、高灵敏性和成本低等优点，适合流行病学的大规模筛查。 本论文率先建立了检测路氏锥虫的LAMP体系，明确了检测路氏锥虫的最佳 反应温度为62℃，最佳反应时间是60rain。我们对LAMP检测路氏锥虫的特异 性和灵敏性进行了详细的研究，结果表明采用的引物对路氏锥虫有甚高的特异性， 为100 fg，LAMP检测路氏锥虫的灵敏度比普通PCR高lO倍。此外，我们的研 究结果证实，用FTA滤纸保存的血样无需作DNA纯化处理便可直接用于LAMP 反应，结果与预处理的没有明显差异，但是未经处理的FTA滤纸保存的血样不能 直接用于普通PCR反应。这表明LAMP反应对大分子有机物的耐受性要比普通 PCR强。 本论文用三种方法检测了238只野生大鼠血样，结果表明：病原学检测(显 测阳性率为1 出阳性，PCR检测的阳性样本在LAMP中均检测出阳性。PCR检测的阳性率高 于病原学检测，而LAMP检测的阳性率高于PCR检测。对比这三种方法，我们 发现，LAMP检测路氏锥虫有更高的灵敏性，更适合用于路氏锥虫大样品量的流 行病学研究。 本文利用FTA滤纸采集血液样本，结合LAMP技术检测路氏锥虫，建立了 从样本采集、运输、贮存和检测于一体的一套完整LAMP检测体系。基于利用 LAMP检测路氏锥虫的研究，我们的结果表明LAMP是一种快速、简便、成本低、 高灵敏性和高特异性的检测路氏锥虫的方法，为人兽路氏锥虫病的检测提供了一 种新的分子检测手段，对路氏锥虫的流行病学研究有重要意义。 关键词：路氏锥虫：褐家鼠(Rattusnorvegicus)；屋顶鼠(Rattusrattus)；检测； isothermal PCR；LAMP(Loop—mediated FTA滤纸：野外样本 ll Detectionof lewisifromrats Trypanosoma and fromfield (RattusnorvegicusR．rattus)collected PCRand isothermal by loop—mediated Major：Microbiology Name：Hai—Jun Tang Lun Supervisor：Prof．Zhao—Rong A