利用斑马鱼模型究HFHG45基因在血祖细胞形成与分化中的作用.pdf

30094 Y27删嬲 摘 要 在胚胎发育过程当中，血液与血管都起着重要的作用。人类许多 疾病的发生都与血液或血管发育异常有密切联系。血液与血管起源于 同一种细胞，称之为血祖细胞。血祖细胞来源于中胚层，它会分化形 成血液祖细胞以及血管祖细胞。血液祖细胞产生的原始血细胞参与初 级造血，而血液祖细胞形成的造血干细胞调控次级造血产生成熟的红 细胞、髓系细胞以及淋巴细胞。血管祖细胞主要分化为血管内皮细胞， 最后形成动脉、静脉和淋巴血管等。血液与血管的整个发育进程是在 繁杂而精密的分子信号网络的调控下进行的，任何关键分子调控异常 都可能会导致严重的发育缺陷或重大疾病。到目前为止，调控造血体 系与血管体系发育的分子机制不是非常清楚，因此研究血液与血管发 育进程的关键分子有助于完善血液与血管发育过程的分子信号网络， 从而对有关疾病的治疗提供新的分子靶点和治疗方案。 本文利用模式生物斑马鱼，研究一个尚未有功能报道的新基因 脚删5对血祖细胞的形成与分化的影响。为了探究翩甲日G钙基因 的时空表达谱，分别对斑马鱼发育各个时期的胚胎进行原位杂交和 RT-PCR，分析结果表明：翩删5在斑马鱼中广泛表达且高表达于 血液血管处。为了更加直观观察爿=磁酊钙的表达情况，建立}玎?HG45 启动子绿色荧光转基因斑马鱼品系粥(觑％酊45：馏勿)，分析结果发 现：表达绿色荧光区域基本与原位杂交探针表达区域接近。研究 如?HG45蛋白表达情况，制备了斑马鱼Ⅲ’HG45多克隆抗体， 表达；在成年斑马鱼的心脏、血液、脑和肌肉组织有表达且在血液中 的表达较强烈，这些结果提示：H磁船钙基因可能与斑马鱼血液发育 有关。利用斑马鱼H磁船钙基因特异性的mo印h01ino反义寡核酸敲 T 万方数据 减其表达，发现斑马鱼血管与血液发育异常。为了深入研究H唧钙 基因的生物学功能，运用雕儿EN敲除技术得到3个斑马鱼翩甲嬲45 基因的敲除品系，敲除系F2代致死分析表明H聊钙基因敲除纯合 子突变致死；敲除系的表型分析发现斑马鱼节间血管、尾部动脉和静 脉发育受到抑制以及血细胞数目明显减少。以上结果表明职嬲钉 基因在斑马鱼血液与血管形成中起着十分重要的作用。 该基因是怎样影响斑马鱼血液与血管发育的呢?首先研究 翩吒酊钙基因是否影响斑马鱼的初级造血。胚胎原位杂交检测血液标 志基因sc八朋嬲、却J『和办66订，原始红细胞祖细胞标记性基因肜勉Jj 原始髓系细胞祖细胞标记基因p“．J『均在翩甲嬲钙敲除纯合子中表达 显著下调，O．Di觚isidine染色显示崩％旧45敲除纯合子血红蛋白表 达减少。这些结果表明：翩甲日G钳是直接调控原始的血细胞发育的。 接下来研究丘删5对斑马鱼次级造血的影响。淋巴祖细胞标记基 因懈J『原位杂交结果显示：在斑马鱼翩甲日G45敲除纯合子中几乎没 有懈J『的表达，成熟髓系细胞数目减少。通过中性红与苏丹黑染色 发现，髓系细胞分化形成的巨噬细胞和中性粒细胞的数目都受到了影 响。c删6等造血干细胞标记基因的原位杂交以及在粥亿，缈6j昭私 肋，?朋劬P例夕双转基因斑马鱼中敲除翩甲日G45表达分析发现，其背 部主动脉中没有造血干细胞标记c璎)，6的绿色荧光与内皮细胞标记 胁，的红色荧光共表达的细胞，实验证明劢％酊45敲除纯合子中起源 于背部主动脉中的内皮细胞没有正常形成造血干细胞。因此，可以说 明： 础45是斑马鱼次级造血所必需的。为了研究劢甲册45对斑 马鱼血管内皮细胞的影响，利用粥∽池?e加)与粥(蒯Ⅳ：聊C办P删) 2种转基因斑马鱼品系，敲除H唧钳基因的情况下分析斑马鱼血管 的发育情况，其荧光表达直观清楚地显示敲除H磁酊钙导致斑马鱼 II 万方数据 节间血管、尾部主动脉和静脉的形成受到明显抑制。内皮细胞标记基 因．