人源DNA聚合δ分离纯化方法的研究.pdfVIP

江苏大学硕士学位论丈 摘 要 人源DNA聚合酶6(Pol 组成的异源四聚体，在参与染色体DNA复制和各种形式的DNA损伤 修复过程中都扮演着十分重要的角色。然而，不论是从培养的动物细 胞或组织中分离提取的天然酶复合物，还是通过基因工程手段获得的 重组酶蛋白复合物，其酶的纯度及产量均无法满足对其结构和功能深 入研究的需要。 6 的一个或多个亚基装配到杆状病毒表达载体pFBDM中，构建出含Pol 6异源四聚体或不同亚基组合的重组杆状病毒，并在Sf-9昆虫细胞中 过量表达。为了高效大规模地分离纯化出高质量的Pol6各咂基不同组 合的蛋白复合物，本研究通过制备抗催化大亚基p125的抗体，利用 CarboLink聊CouplingGel制备抗p125的免疫亲和层析柱。利用所制备 Mono ml感染的Sf-9细 的免疫亲和层析柱，结合FPLC Q柱，从500 胞中，获得了大约5mg的Pol 为引物．模板或以单链环状M13DNA为模板进行的DNA活性分析中， 利用本分离纯化策略所获得的Pol6四亚基酶复合物具有与从真核细 6的其它各亚基 胞中分离提取的天然Pol6相同的酶活性。同时，Pol 复合物：核二聚体p125／p50，三聚体p125／p50／p68(Pol63一p12)和 p125／p50／p12(Pol63-p68)，也以相同的方法被构建、在Sf-9细胞中过表 达、分离纯化并进行酶活性的对比分析。 通过所制备的免疫亲和柱及改进了的分离纯化策略，能够极大地 提升大规模、高酶活的人源DNA聚合酶6分离纯化的效果。本研究为 从癌症发病的源头上深入研究由于Pol 6功能改变而引起遗传基因组 人源DNA聚合酶6分离纯化方法的研究 不稳定所致肿瘤或其它疾病发生的机制提供了一个重要平台。 关键词：DNA聚合酶6；免疫亲和层析；MultiBac系统；异源四聚体； 亚基复合物 江苏大学硕士学立论丈 ABSTRACT well as MammalianDNA 6)is characterizeda polymerasedelta(Pol associatedheterotetrameric ofthe consistingp125，p50， tightly complex and subunits．Itis to a centralrolenot in p68 p12 thoughtplay only chromosomalDNA butalsoinvariousDNA replication repairprocesses． 6 However,theof activePoleitherasanative availabilityhighlypurified form its orasareconstitu