人类免疫缺陷病诊断抗体的亲和力成熟.pdfVIP

摘要 摘要 9E8是本实验室筛选获得的一株针对人类免疫缺陷病毒(HumaIl 成功应用到本实验室开发的HⅣ诊断试剂盒中，但其灵敏度和特异性都还有待 提高。 本研究的目的就是利用噬菌体展示技术对HIV诊断抗体9E8进行亲和力成 熟，进一步提高HⅣ诊断的灵敏度和特异性。首先，用IUPCR的方法从杂交 瘤细胞中调取鼠源抗体9E8的可变区基因，将其构建成单链抗体VH．(G4S)3．VL 的形式，展示到噬菌体pIII蛋白上，并验证ScFv的活性。确定噬菌体ScFv具 有结合活性后，用CDR替换的方法，确定抗体抗原结合的关键CDR区。将 9E8．ScFv的VH和VL氨基酸序列分别输入到NCBI数据库中，按照骨架区同源 度最高而CDR氨基酸序列差异最大的原则，搜寻人源抗体的cDR序列作为CDR 方法检测活性，最终确定了三个关键CDR区，即：HCDI也、HCDR3和LCDR3。 确定了抗体抗原结合的关键CDR区之后，接下来就是对关键CDR区实施单 点突变，以此获得每个关键CDR区的突变热点及其氨基酸变化规律。根据突变 热点及其氨基酸变化规律，设计简并引物，构建了3个亲和力成熟初级噬菌体文 以p24作为抗原，用固相筛选的方法对初级噬菌体文库进行筛选，每个初级库筛 选三轮，并分别挑取一定数目的单克隆菌落进行检测。再以初级噬菌体文库筛选 三轮后的多样性克隆序列为模板，进一步构建亲和力成熟次级噬菌体文库 9E8HK(库容：8×108)，用更加苛刻的筛选条件对其进行筛选。然后，挑取800 个单克隆菌落进行检测，并用ScFV竞争的方法对高亲和力噬菌体单链抗体进行 初步筛选，最终8个结合活性最好的克隆进行真核表达，得到了一株亲和力提高 5．7倍的抗体9E8HK．49l，其亲和力达到5．64×10‘11M。 最后，对抗体9E8HK一49l进行灵敏度和特异性的评估，结果都有了很明显 的提高，是一株具有潜在应用价值的抗体。 关键词：人类免疫缺陷病，噬菌体展示，亲和力成熟， CDR替换，抗体库 Abstract Abstract a 9E8is Mu血e HⅣw勰discoveredi110ur monocloml锄tibodyaga泌t lab，its nowithasbeen t0ourlab’sHⅣ 3．23×10’10M，狮d amnit)，is successmlly印plied dia黟losticl【its．HoweVer，itsse璐itiVity肌d t0be Specificit)，needilIlpr0Ved． T11e of“sresearchis 9E8with toincreasethe pu印ose afnIli哆of phagediSplay Fv of9E8舶m seIlsitiV时觚dSpecific埘ofHⅣdiagnosis．FirSt，obtaill血e gene withRT．PCR．CoIlstmctednle inthefomlof Hyb—doma gene VH-(G4S)3一VL，and 0nme detected the used CDR diSplay p