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人类新发NL63冠状病毒木瓜样蛋白酶调控宿主抗病毒天然免疫反应及其分子机制 中文摘要 人类新发NL63冠状病毒木瓜样蛋白酶调控宿主抗病毒 天然免疫反应及其分子机制 宿主免疫系统分为天然免疫(IIlllate imm_uI】i动。天然免疫是非特异形式的免疫应答，是以识别和清除病原体为主的 第一道防御屏障。天然免疫反应主要发生在病毒感染的早期且与抗病毒感染紧密 相关。病毒入侵后，宿主会立即启动天然免疫应答，通过细胞表面及细胞质中的 模式识别受体(P融U检测各种病原体相关分子模式(P舢—：P)，例如病毒RNA，细 菌细胞壁成分等，启动一系列的细胞信号转导级联反应。活化的模式识别受体通 过同型互作与衔接蛋白相接，启动信号转导。信号转导过程中通过磷酸化及泛素 化修饰激活信号通路中一些重要的基因，诱导蛋白激酶(如IKKp—IKK0c-IⅪ研和 终引发促炎症细胞因子及I型干扰素基因的转录，共同介导抗病毒效应。 冠状病毒是一类拥有庞大I斟A基因组的包膜病毒。至今发现的人类冠状病 种，其中NL63和HKUl是继SARS冠状病毒后出现的两种人类新发冠状病毒。 HoekL首先报道的一种单股正链 NL63冠状病毒是2004年由荷兰学者V缸der RNA病毒，呈世界性分布，流行病学检测发现，NL63冠状病毒在儿童和成人(特 别是儿童)呼吸道感染中的阳性检测率高，已成为人类呼吸道感染的主要新发病 原之一。 冠状病毒与宿主间的相互作用决定了其致病性和免疫特性。冠状病毒感染宿 主后会立即启动抗病毒天然免疫反应，病毒为了躲避宿主机体复杂的防御体系， 必然对宿主细胞内的信号转导进行干预和调节。近年来，越来越多的研究表明， 病毒通过编码多种功能蛋白调控宿主的抗病毒天然免疫反应。例如，小核糖核酸 病毒编码的3C蛋白酶一方面剪切复制聚合酶前体，另一方面抑制ⅪG—I和NF-1cB 的活化。我们前期研究表明，NL63冠状病毒Ilsp3编码的木瓜样蛋白酶(PLP) 核心结构域具有DUB活性，而PLPl则没有。PLP2作为一种干扰素拮抗剂，通 活性与其干扰素拮抗作用是相互独立的。由于编码PLP2的nsp3位于细胞内质网 (ER)膜上，因此NL63冠状病毒nsp3编码的木瓜样蛋白酶应该是膜定位的。目 人类新发NL63冠状病毒木瓜样蛋白酶调控宿主抗病毒天然免疫反应及其分子机制 前对于NL63冠状病毒编码的木瓜样蛋白酶(PLP)调控宿主的抗病毒天然免疫 反应机制，以及可溶性木瓜样蛋白酶(PLP2)与膜定位的木瓜样蛋白酶 (PLP2．TM)之间的差异性尚不清楚。围绕这一问题我们针对NL63冠状病毒编 码的膜定位木瓜样蛋白酶(PLP—n山进行更加深入的研究，主要结果如下： 一．NL63冠状病毒编码的木瓜样蛋白酶(PLP)在细胞内的定位研究 重组体及蛋白酶活性催化位点突变体(PLPl．TMC1062A，PLPl．TMH1212A， PLPl一TM D1225A，PLP2-田M C1678A，PLP2-TMH1836A，PLP2-TMD1489A)。 (二)对NL63PLP蛋白酶进行进行免疫荧光染色，确定了nsp3编码的可溶 性PLP和膜定位的PLP．TM在细胞的定位情况。结果表明膜定位前后蛋白表达 位置发生改变，PLP均匀的分布于细胞质中，而PLP．TM则集中分布于核周内质 网上。同时，我们通过westem blot检测到PLP．TM及酶活性突变体的表达条带。 二．PLP．TM的生物学特性研究 (一)利用DUB检测技术对NL63PLP的去泛素化活性进行分析，发现 活性；同时，PLP2．喇的蛋白酶催化活性位点(C，H，D)突变后，其DUB活性 PLP的底物特异性进行研究，发 (二)利用DUB和去ISG检测技术对NL63 现PLP2．TM对U帖．K48和U咕一K63连接的多聚泛素化没有表现出特异性；其次， 性，说明膜定位对于NL63冠状病毒编码木瓜样蛋白酶的功能发挥具有重要作用。 三．PLP．TM负调控宿主干扰素表达活性研究 (一)利用双荧光素酶报告基因检测技术对PLP．TM干扰素拮抗活性进行分 下I型干扰素的表达。说明膜定位木瓜样蛋白酶(PLP．T