人类免疫缺陷病重组包膜蛋白gp140的表达纯化及活性鉴定.pdfVIP

摘要 摘要 艾滋病(AIDS)自1981年被发现以来，便在世界范围内迅速蔓延，越来越 多的人被人类免疫缺陷病毒(HⅣ)感染，人类健康和社会都受到了极大的危害。 对HⅣ的有效控制、预防及治疗是人类迫切想要解决的问题。HⅣ的包膜蛋白 含有HⅣ最重要的抗原成分，同时也是其构成成分中最容易变异的组分，对于 HⅣ诊断试剂、中和抗体和疫苗的研究都至关重要，长期以来一直是HⅣ的研 究热点。然而HIV包膜蛋白的糖基化程度很高，且很难分泌表达，这些都不利 于蛋白的获取，对其结构和功能的研究工作造成了阻碍。 本研究通过对HⅣ包膜糖蛋白gpl60进行基因改造，获得了能够分泌表达 膜结构域和胞内结构域，对gpl20末端的蛋白酶水解位点进行定点突变，用哺乳 动物细胞表达中常用的tPA信号肽代替gpl60自身的信号肽，并在目的蛋白末端 40b2．Ilis。 加入了纯化标签His．tag，我们将其命名为gpl 由于HⅣ包膜蛋白gpl40对糖基化修饰水平要求很高，一般的外源蛋白表 达系统难以胜任。本研究选用哺乳动物细胞HEK293．6E成功地分泌表达出糖基 化完全的gpl40b2．1lis，并对其瞬时表达条件进行优化，采用真核表达载体pTT5， 换用廉价的无血清培养基，以及使用改良的转染方法，使得gpl40b2．11is产量提 高且杂蛋白含量少。 经过粗纯、镍离子金属螯合亲和层析以及阴离子作用层析纯化，获得了纯度 高达85％以上且反应性较好的gpl40蛋白，为后续对HⅣ包膜蛋白分子结构与 功能的研究提供了一定的信息，且有利于HⅣ诊断试剂的提高及中和抗体和疫 苗的研究。 关键词：gpl40；HEK293．6E；瞬时表达 Abs仃act Abstl·act SiIlceidentifiedill198 is alloVermeworld．Moreth肌 1，AIDS spreading people eVerare causesserious t0 liV№wimHⅣwhich d锄agepeople’health锄dsoci啊 de硒ceand toHⅣarewhat waIlt E脏ctiVemeⅡlodsonconn．01， therapy people moSt ofHIVarein inllllinently．Theimponant印itopesHⅣ饥、，elopeglyc叩roteiIls， wllichmutatewith ahot of highf}equency．AsspotHⅣHⅣeIl_VelopeglycoproteiIls are t0me onHⅣdia印ostic andVaccine． ve搿si印ific锄tstudy reagent，锄tibody t0 anddimcult However，HⅣenvelopeglycoproteir塔arehigMyglycosylated secretion t0understa】ndt量lemolecularbasisofHIV expression．Efrorts e11Velope m