利用体细胞核移技术生产猪克隆胚胎的研究.pdf

摘要 猪是人异种器官移植理想的器官来源。体细胞核移植为人们生产不引起免疫排斥以及无内 源性病毒的猪提供了可能。本研究系统地研究了猪体细胞克隆相关技术环节，旨在搭建一个能有 效生产猪克隆胚的平台。主要内容如下： 利用组织块培养法建立了中国实验用小型猪9个40d胎儿成纤维细胞系和1个成体成纤维 细胞系。利用血清饥饿以及接触抑制对细胞进行细胞周期同期化处理，发现细胞同期到G0／G1 期的效率相同，而且在处理2d之后，G0／131期细胞比例不再有显著增加。结果表明胎儿成纤维细 胞对血清饥饿以及接触抑制的反应相当，同期处理2d即可为核移植提供足够的供体细胞。 比较了不同培养基，氧分压以及添加胰岛素和LIF对猪卵母细胞体外成熟威熟后孤雌激活 发育的影响，首次尝试将一种新的胚胎培养基PZM-3用于猪卵母细胞体外成熟，还探索了猪体外 成熟卵母细胞孤雌激活方案。结果如V：NCSU．23中，卵母细胞核成熟明显优于在TCMl99中成 it It 熟的效果(p(o．05)；1．4kv,100stlDC电激活后，卵母细胞死亡率明显高于2．0kv／cm．30stIDC 和2．Okv／cm，60us，IDC处理组。但激活后三组间胚胎卵裂率(分别为：72．6％vs．85．9％．73．2％) 和囊胚率(分别为：32．I％vs．49．4％，39．o％)相似；化学激活后，胚胎卵裂以及囊胚率都明显不如 氧核成熟显著优于低氧；以改进的PZM．3成熟卵母细胞，核成熟上仍然是高氧优于低氧。若不 1．t 考虑气相影响，PZM-3的成熟效果明显不如NCSU-23；添加5 g／ml胰岛素后卵母细胞成熟效 IU／ml 果显著提高，但是成熟后激活发育没有显著改善。而添加1000 LIF卵母细胞核成熟率不但 没有明显提高，反而孤雌激活后囊胚率急剧下降，尽管卵裂率以及囊胚细胞总数都没有明显改变。 上述结果表明@NCSU23是猪卵母细胞比较理想的培养基，其成熟卵在2．0kv／cm，30us，】DC或者 2．0kv／cm，60las，IDC电击参数激活下发育比较好；②高氧对卵母细胞核成熟有利，但附植前孤雌 胚胎发育具有培养基依赖性；⑧添加Insulin可以改善卵母细胞核成熟，而添加LIF对卵细胞质 成熟有害；④PzM．3如果应用于卵母细胞体外成熟还需要进一步优化。 比较了IVF,PA以及SCNT胚胎的发育率和囊胚质量。三者发育率相似(囊胚率分别 it BSA中添加5 囊胚发育影响不大(211％vs．26．6‰p0．05)。在NCSU-23+4mg／ml g／ml胰岛素 IU／ml 对胚胎发育没有明显促进作用，而添加1000 LIF也没发现有损害早期发育的情况。上述结 果表明．对孤雌胚或者体外受精胚理想的培养基，当用于克隆胚胎培养时却不一定是最佳的选择 u Insulin或者 孤雌胚胎在体内发育能力差，可能和ICM／总细胞数很低有关。添加5g／ml 10001U／mlLIF对孤雌激活胚胎早期发育没有显著影响。 利用脂质体转染技术建立了转GFP的猪胎儿成纤维细胞系，尝试了生产转GFP胚胎的可能 性，同时系统研究了供体细胞转染与否、传代次数，准各方式、细胞周期同期化、细胞年龄、细 胞形态以及细胞性别等对克隆胚胎早期发育的影响。结果如下：用转GFP的细胞获得克隆胚胎 p0．05)以上的组，但囊胚率没有明显差异(14．O％vs．11．2％)；在融合率上，光滑圆形细胞明显高于 表面粗糙的细胞组(76．8％vs．47．8％，p0．05)，但克隆胚卵裂率以及囊胚率没有显著的差异；用液 氮冻存复苏的细胞做供体可以得到克隆囊胚(4．2％)，但其效率明显不如胰蛋白酶现场消化法