人乳铁蛋白基因克隆及其在乳酸菌中的表达.pdfVIP

人乳铁蛋白基因的克隆及其在乳酸菌中的表达 中文摘要 【目的】 乳铁蛋白也称乳转铁蛋白，是乳汁中主要的铁结合蛋白，广泛分布于多种组 织、细胞内，具有非特异性免疫、参与铁代谢和细胞生长调节等功能。与其它动 物乳铁蛋白相比，人乳铁蛋白(hLF)更适合用于人类的营养保健。选择合适的 表达系统进行hLF基因的异源表达，是将hLF用于人类营养保健的重要途径之一。 在目前常用的表达系统中，可用于发酵生产酸奶的食品级乳酸菌表达系统应是一 个不错的选择。本研究通过克隆hLF基因，并构建出用于hLF表达，以乳糖为选 择标记的食品级乳酸菌表达系统，目的就是要构建出可表达hLF，并最终可用于 生产富含hLF酸牛奶的重组乳酸菌。 【方法】 本研究用RT-PCR方法从人乳腺组织中扩增hLF cDNA序列，将其克隆入pMDl8 一T载体后进行测序并与从GeneBank中收藏的hLF基因对比鉴定。选择序列比 对正确的hLF基因与乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149进行连接，电击转化入食 用SDS和Westernblot分析观察目的蛋白的表达情况；采用超声破碎重 组菌收集上清液，通过抑菌圈实验观察目的蛋白是否具有生物学活性。 【结果】 用RT-PCR方法从人乳腺组织中成功克隆出hLFcDNA序列，测序结果表明克 隆出hLF 99．8％。 表达载体及重组菌的构建试验结果表明，成功构建出了以乳糖为选择标记、 SDS—PAGE和Western 乳链菌肽(Nisin)诱导3小时后， blot分析的结果显示， 目的蛋白获得了特异性的表达；重组乳酸菌超声破碎后的上清液抑菌圈实验结果 显示，目的蛋白具有一定的抑制大肠杆菌增殖的活性。 【结论】 对所构建的重组乳酸菌质粒DNA进行PCR、双酶切及测序鉴定的结果表明，乳 取的蛋白进行SDS和Westernblot分析结果表明，hLF在重组乳酸菌中获得 了特异性的表达；抑菌实验表明，重组菌释放的目的蛋白具有一定的抑菌活性。 这为进一步研制开发具富含hLF的营养保健酸牛奶打下了良好的基础。 【关键词】 hLF；克隆；乳酸乳球菌；表达 2 lactis Humanlactoferrin and inLactococcus genecloningexpression Abstract [Objective] Lactoferriniscalledferritin themain combinedwithiron． transferrin，is protein distributedinvarious and It cells，with widely organizations nonspecificimmunity, in metabolismandcell withthe iron participating growthregulating．Compared lactofeninfromother lactoferrinfromhumanis moresuitable animals，the certainly