不同倍性鲫鲤蛋质代谢相关基因的克隆与表达研究.pdf

舢舢Ⅲ嗍Ⅷ舢Ⅲ舢圳删Ⅲ Y21 47257 中文摘要 本实验室在世界上首次制备了两性可育的异源四倍体鲫鲤，该四 倍体鲫鲤与二倍体红鲫杂交获得的三倍体湘云鲫具有明显生长优势， 分析认为主要与其不育有关。众所周知，鱼类生长主要通过机体蛋白 质的合成来完成，蛋白质代谢直接影响鱼类生长作用，外源蛋白在鱼 体内首先降解生成肽类物质和游离氨基酸，肽类物质在肽酶的作用 下，进一步降解生成小肽和游离氨基酸，肠道转运载体负责小肽和氨 基酸的吸收，氨基酸在肠道或进入体内在肝脏发生代谢作用。因此， 本研究克隆了影响不同倍性鲫鲤蛋白质代谢的3个关键基因，并探讨 了其基因的表达特征，内容总结如下： N，APN)是一种从N末端酶切肽链 1．氨肽酶N(锄inopeptidaSe 的蛋白质消化酶，在蛋白质消化中发挥十分重要的作用。本研究克隆 红鲫、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤APN的部分cDNA序列，结 果表明不同倍性鲫鲤APN序列相对保守，系统进化树显示红鲫、三 倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤亲缘关系最近。实时定量PCR技术分 析发现三倍体湘云鲫APN在肠道组织分布最多，不同倍性鲫鲤APN 基因具有母性遗传特性，参与了早期胚胎发育各时期卵黄囊蛋白的消 化，但三倍体湘云鲫APN在早期胚胎发育的多个时期均有较高的表 达水平，说明在早期胚胎发育阶段，三倍体湘云鲫对蛋白质的消化效 率高于红鲫，揭示了它对蛋白质代谢具有消化优势。 2．小肽转运载体(01igopeptide 的寡肽转运载体(oligopeptide 上皮细胞PepTl对蛋白质消化产物中的小肽吸收起关键性作用。本研 究利用同源克隆和RACE方法克隆了红鲫、三倍体湘云鲫和异源四倍 相对保守，氨基酸序列相似率在88．8～93．8之间，在第564个氨基酸 位点，三倍体湘云鲫缺失一个氨基酸。利用实时定量PCR技术对湘 云鲫组织表达检测，结果表明三倍体湘云鲫PepTl主要分布在肠道前 段，并沿肠道纵向表达量逐渐降低，说明了三倍体湘云鲫肠道前段是 蛋白质代谢产物中小肽的主要吸收场所。同样，利用实时定量PCR 技术对不同倍性鲫鲤早期胚胎发育不同时期进行分析，结果发现， PepTl在不同倍性鲫鲤具有母性遗传特性，三倍体湘云鲫PepTl在 早期胚胎发育的多个时期有较高水平的表达，说明在早期胚胎发育阶 段，三倍体湘云鲫对蛋白质的吸收效率高于红鲫，揭示了它对蛋白质 代谢具有吸收优势。 3．谷氨酸脱氢酶(glutamate 代谢的重要街接点之一，对氨基酸代i身j．有十分重要的作用。本研究克 隆红鲫、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤GDH全长cDNA序列，结 果表明三种鱼GDH氨基酸序列高度保守。实时定量PCR分析发现不 同倍性鲫鲤GDH广泛分布在所有组织，在繁殖和非繁殖季节，三倍 体湘云鲫肝脏组织GDKmRNA表达量均高于红鲫。早期胚胎发育阶 段，GDH m】5斟A在三倍体湘云鲫表达量最高，说明在早期胚胎发育 阶段，三倍体湘云鲫对氨基酸的代谢效率高于红鲫，揭示它具有氨基 酸代谢优势。 4．研究了二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤生长、 II 血清生化指标和蛋白质代谢相关基因表达的变化。每种倍性的鱼设1 个处理，每个处理三重复，投喂初始平均体重59．Og左右的同龄鱼30 天。结果表明三倍体湘云鲫增重率是二倍体红鲫的2．13倍。湘云鲫 相对红鲫血清尿素氮、甲状腺激素(T3、T4)浓度降低，谷草转氨 酶和谷丙转氨酶浓度升高，成体肠道APN、PepTl和肝脏GDH基因 的表达量明显升高，说明了在成体发育阶段，湘云鲫具有明显蛋白质 代谢优势。 5．研究了蛋白质水平和种类对湘云鲫灿)N、PepTl、GDH基因表 达的影响。配制了5种蛋白水平和2种蛋白种类的半精制饲料，每种饲 料设1个处理，每个处理三重复，饲喂初始体重509左右的同一批孵化 湘云鲫40天，结果表明饲料蛋白水平和种类均能显著影响湘云鲫肠道 和蛋白浓度有相关性；蛋白