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RTA系列融合蛋白的表达及其抗肿瘤功能研究 中文摘要 RTA系列融合蛋白的表达及其抗肿瘤功能研究 (捅 要) Ⅵral protein22(VP22)是I型单纯疱疹病毒的壳皮蛋白，作为一种细胞转导肽 (Cell—PenetratingP印tides，CPPs)，能介导其融合蛋白进入细胞并具有细胞间穿梭功能。 TAT是来自HIV的含11个氨基酸的短肽，也是一种转导肽，被广泛用于转导肽段、寡核 苷酸和蛋白进入细胞。促性腺激素释放激素(90nado呐phinreleausing 下丘脑分泌的含有十个氨基酸的短肽类激素，它可以作用于垂体前叶促进促性腺激素的分 泌。文献报道在乳腺多种肿瘤细胞表面都有G心沮受体分布，这为GnRH作为大分子药物 domain，ODD) 载体提供了科学依据。氧依赖性降解区域(oxygeIl—depelldent deFadation 可以控制缺氧诱导因子一1a(HIF．1a)存在与否，在常氧条件下会通过羟化特定位点的脯 氨酸，进而使HIF—la被蛋白酶降解。缺氧是实体肿瘤的特征性病理改变，含有ODD的融 合蛋白可以稳定存在。蓖麻毒素A链(砌cin 它是一种I汛A特异性的N一糖苷酶，可催化核糖体60s亚基中28SrRNA的一个高度保守 的环状结构脱去一个特殊的腺嘌呤(在大鼠中为A-4324位)，从而使蛋白合成功能受阻， 导致细胞死亡。 本课题目的是以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用删、仉虹以及VP22 的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的降解作用减轻R1A对正常细胞的毒 肠杆菌BL21，诱导R1『A融合蛋白的可溶性表达，超声裂解表达后菌体，利用融合蛋白上 的组氨酸标签进行亲和层析纯化目的蛋白，在分子、肿瘤细胞和动物整体水平研究融合蛋 白的肿瘤抑制活性。 实验方法：应用无细胞系蛋白合成抑制实验测定融合蛋白对蛋白合成的抑制作用； SRB法测定融合蛋白对肿瘤细胞生长的抑制作用；细胞免疫荧光法、细胞免疫化学法测定 融合蛋白是否可以进入肿瘤细胞以及融合蛋白在细胞中的定位：应用流式细胞术测定融合 蛋白诱导肿瘤细胞凋亡。以人肺腺癌细胞系A549细胞建立Balb／c裸鼠荷瘤模型，将建模 用腹腔给药的方式(实验组融合蛋白3 mg／l(∥天，对照组生理盐水200pL／只／天)测定融 合蛋白在体内抑制肿瘤生长的作用，同时对荷瘤小鼠的血浆生化指标进行测定初步判断融 合蛋白对动物的毒副作用。 实验结果：①构建了pET28a-R1队系列原核表达载体，并利用该系列载体表达出可溶 性的融合蛋白。②利用融合蛋白N端的His．tag，采用亲和层析的方法进行了R1队融合蛋 l R1隗系列融合蛋白的表达及其抗肿瘤功能研究 中文摘要 生长的作用随着蛋白浓度的增加而呈增强的趋势；其中n犋R1队较其他R1队融合蛋白的 细胞的增殖抑制作用。对HcpG2细胞和Hela细胞：融合蛋白在常氧条件下对细胞均有增 殖抑制作用，且成剂量依赖性，在缺氧条件下也都有增殖抑制作用，但无剂量依赖性：对 浓度大于10‘7M时抑制作用较明显，其中Ⅸr-I淞的作用比其他融合蛋白显著。同样， 用在常氧和缺氧条件下无明显差别。⑥流式细胞术结果显示，在常氧状态下弛～系列融 h最强，与培养基 合蛋白可以随时间延长增加A549细胞早期凋亡的百分率，其作用在48 对照相比，TAT-R1A在给药48h时可显著诱导A549细胞发生早期凋亡。⑦测量、计算各 组实验动物瘤体体积发现，与对照组比较R1隗、Gl衄．R1队、似r-R1隗显示了较好的抑制 瘤体生长的趋势，但是给药期间各组的动物体重分析表明RTA和仉堪RTA对实验动物的 毒性较大，导致动物体重明显下降。⑨动物血浆生化指标测定结果表明，融合蛋白对动物 的肝、肾功能都有不同程度的影响，以R1队和TAPRl隗最