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microRNA参与脑肿瘤干细胞凋亡的 研究 博士研究生：孟伟 指导老师：马文丽教授 摘要 研究背景与目的． ： ． ． stem 肿瘤干细胞(cancercells)是存在于肿瘤中的-d,部分具有干细胞性质 的细胞群体，它具有自我更新的能力，是形成不同分化程度的肿瘤细胞和肿瘤不 断扩大的源泉。到目前为止，人们已成功的从造血系统恶性肿瘤、 乳腺癌和脑 肿瘤患者组织中分离并培养出各自的肿瘤干细胞。这证明在肿瘤细胞群体中确 实存在一类极少数的能使群体扩增的肿瘤干细胞。 肿瘤细胞具有异质化的特性，即由一个克隆来源的肿瘤细胞在生长过程中， 形成在侵袭能力、生长速度、分化程度、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性 等方面有所不同的亚克隆。肿瘤细胞异质性的现象只有用肿瘤干细胞的理论才 能解释，即肿瘤干细胞在不同选择压力下，向不同功能方向分化、成熟，造成肿瘤 细胞的群体漂移，从而形成异质性。因此，肿瘤干细胞是肿瘤的根源，消灭了肿 瘤干细胞就意味着消灭了肿瘤。长期以来，人们发现实体瘤的缺氧程度与肿瘤的 不良预后相关。传统的肿瘤化疗主要针对迅速增殖的瘤细胞，TSC在细胞群中 增殖缓慢，对化疗不敏感，TSC的膜表面蛋白受HIFs的调控，在低氧环境中能 高效地排除药物，保护TSC不被杀灭，其对通过减少肿瘤细胞负载的治疗方法 有抗性，而TSC在缺氧的环境中也能得到更好的保护。缺氧的细胞对放疗也不 敏感，低氧是胶质母细胞瘤的普遍特征，研究表明胶质母细胞瘤干细胞放射抗 性归结于细胞DNA修复能力的增强，提示在缺氧状态下，癌症干细胞的辐射抗 性会显著提高。因此不论是化疗或是放疗，缺氧都是肿瘤治疗的重要靶点。 摘要 miRNA在肿瘤发生、发展、侵袭、转移中起重要作用，相关领域的研究已 取得很多成果，为miRNA在肿瘤诊断和治疗中的应用奠定了基础。但miRNA 在肿瘤中表达失调的机制等问题仍需要进一步研究。随着研究的深入，miRNA 与肿瘤的关系必将得以阐明，miRNA在肿瘤防治中的应用也必将会有更广阔的 前景，成为肿瘤治疗的新策略。 用细胞和分子生物学实验对其进行功能研究，为脑胶质瘤提供发病机制提供新 的思路，也为脑胶质瘤的分子诊断和miRNA治疗奠定基础。 研究方法 1．将U87细胞接种于含B27、肝素、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子 待U87细胞增殖形成细胞球3～4 d后，吸取上清培养液(含细胞球)，重新 吹打成单细胞悬液，按1：2或1：3比例传代。原代细胞球形成并达到100～ 200个细胞后，收集其细胞球，以2％多聚甲醛固定，室温15min；10％驴血清 二抗，室温孵育2 进行阳性CSCs计数。缺氧状态下的细胞培养使用缺氧细胞培养箱，培养条件为 有缺氧相关的miRNAs。 2．以缺氧与正常的U87肿瘤干细胞的总RNA为模版，使用两部法荧光定量 为内标，采用2-AACt方法来计算每种miRNA在的相对定量值。 3取对数生长期U87肿瘤干细胞，计数，无抗生素培养基重悬，按6孔板每 Ⅱ 博士学位论文 RT-PCR (miRNA寡核苷酸模拟物)，转染人脑胶质瘤细胞U87肿瘤干细胞， 检测hsa-let．7i表达量，Western mimic