DA品系大鼠胚干细胞系的建立及多能性检测.pdfVIP

摘要 摘要 stem cells，ESCs)是一类来源于哺乳动物囊胚阶段内细胞团的 胚胎干细胞(Embryonic 多能性细胞。自从1981年人类首次成功建立了第一株小鼠胚胎干细胞以来，由于其能够在 体外无限扩增，并且具有发育的多能性，所以利用胚胎干细胞在基因功能的研究，基因修 饰，以及细胞治疗和临床应用等都有广阔的应用前景。大鼠是第一种用于科学研究的哺乳 动物。由于大鼠体型适中，并且与小鼠相比其生理调节和药理反应等方面与人类的相关性 更近，因此在过去的150年间，大鼠被作为动物模型被广泛地应用于生理学、移植医学、免 疫学、遗传学、神经科学、癌症和老化等领域的研究，尤其是某些特殊疾病，例如神经疾 病和心血管疾病的研究更具有优势。然而，在小鼠胚胎干细胞建立后的二十几年中，人们 一直没有成功的建立起真正的大鼠胚胎干细胞。这就使得大鼠在基因敲除动物模型领域的 研究远远落后于小鼠。直至U2008年，华人科学家应其龙等利用N2827并添加抑制因子(3i： 离得到了具有种系嵌合能力的真正的大鼠ESCs。随后又报道了通过大鼠胚胎干细胞进行基 因打靶(Genetargeting)，并成功获得TP53基因敲除大鼠。从而解决了限制大鼠转基因模型 研究的瓶颈。 养体系，从DA品系大鼠囊胚中分离得到了大鼠胚胎干细胞。经鉴定其具有典型的胚胎干细 胞形态，呈克隆状，贴壁或悬浮生长；碱性磷酸酶染色结果呈阳性，且具有正常的二倍体 细胞核型；经过PCR，免疫荧光染色和Western blot等方法检测，我们所建立的DA大鼠胚胎 长期传代培养仍能够维持自我更新的状态。 DA大鼠胚胎干细胞在无Lifl约条件下可以在体外分化成拟胚体(Embryoidbodys，EBs)； 将大鼠胚胎干细胞注射至UF344品系的二倍体囊胚中可以得到嵌合体大鼠；研究发现囊胚作 为受体相比四细胞胚胎可以得到更高的二倍体嵌合效率；大部分嵌合体大鼠可以存活至成 年，并将其与SD品系大鼠交配后能够得到种系嵌合的子代大鼠。因此，上述研究证明了我 们所建立的DA大鼠胚胎于细胞是具有种系嵌合能力的、真正的大鼠胚胎干细胞。 本研究发现一种新的大鼠胚胎干细胞培养体系(N2827．4i)，即在经典的无血清 N2827．2i培养液的基础上添加了另外两种抑制因子Y-27632矛I]A．83．01。结果表明N2827．4i 培养体系有利于维持大鼠胚胎干细胞体外长期传代培养，并证明了使用该体系可以显著提 高胚胎干细胞的体外增殖速度。研究进一步证明了N2827．．4i培养体系下培养的大鼠胚胎干 细胞具有产生嵌合体大鼠和种系嵌合的能力，尤其是相比传统N2827．2i培养体系可以提高 较高代次的大鼠胚胎干细胞产生嵌合体及种系嵌合效率。 利用大鼠胚胎干细胞做为供体细胞进行大鼠核移植的研究，结果表明体外培养体系不 能支持大鼠核移植胚胎的发育，而利用体内移植的方法可以发育并得到大鼠核移植囊胚。 从这些核移植囊胚中可以分离得到核移植胚胎干细胞(ntES)，经鉴定其具有典型的大鼠 胚胎干细胞形态，并具有一定的多能性。进一步研究的结果表明，大鼠胚胎干细胞核移植 东北农业大学理学博士学位论文 胚胎在体内具有发育至I]E11．5天的能力，而没有获得发育到期的大鼠胎儿。 综上所述，本研究所建立的DA品系大鼠胚胎干细胞系，是具有种系嵌合能力的大鼠胚 胎干细胞。同时，也是国内首次得到真正意义的大鼠胚胎干细胞。该研究成果将会极大的 促迂溷内大鼠胚胎干细胞及大鼠转基因模型领域的研究进展，并且在未来将会用于基因敲 除大鼠疾病模型的制作，最终为人类疾病研究和药物研发提供优良的大鼠疾病动物模型。． 关键词大鼠；胚胎干细胞；多能性：种系嵌合；核移植 II ABSTRACT ABSTRACT stem a of cellwhichcanbederivedfrominner Embryoniccell(ESCs)is