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EB病毒相关胃癌肿瘤相关基因表观遗传学调节机制的研究 中文摘要 目的明确EB病毒相关胃癌(EBV-associatedgastric (EBV-negativegastric factor growth Rb)和转化生长因子131(transformingp1，TGF—p1)基因启动子甲基化状 态及蛋白表达，探讨EBV感染与Rb，TGF．p1基因甲基化及蛋白表达的关系。 方法①选取5种EBV阳性和15种EBV阴性胃癌细胞系作为研究对象， RT-PCR检测上述细胞系WNT5AmRNA的转录表达。②甲基化特异性PCR (Methylation—specificPCR，MSP)及亚硫酸氢盐基因组测序法(Bisufitegenomic gastric time time 态。③实时荧光定量PCR(Real PC氏real quantitative qPCR)检测去甲基化 药物作用前后EBV阳性细胞系和部分EBV阴性胃癌细胞系WNT5A表达。④构建 Blotting mRNA转录表达的影响。⑤采用甲基化特异性PCR ATF2，c．myc和EGFR (methylmion．specific 组化技术检测两种胃癌组织中Rb和TGF．p1蛋白的表达。⑦采用靶向LMPl的小 相关因子MMP9，Survivin，CDK4，EGFR和ICAM．1转录表达。 阳性细胞系中则表达缺失或下调。@MSP检测结果发现5种EBV阳性细胞系中 WNT5A编码基因启动子均表现为不同程度的甲基化，只有部分EBV阴性细胞系 发生不同程度的甲基化。BGS检测结果显示，EBV阳性胃癌细胞系WNT5A编码 基因启动子区49个CpG位点甲基化率显著高于EBV阴性胃癌细胞系，两者间具 WNT5A启动子甲基化状态，结果显示，两组间比较差别均有统计学意义 癌细胞系SNU719，Western 水平没有发生显著变化；而JunB表达明显升高，ATF2和EGFR转录表达显著降 蛋白表达与病人年龄、性别、分化程度和肿瘤部位无相关性，但与肿瘤浸润深度和 淋巴结转移相关沪均0．05)；TGF．p1启动子基因甲基化与病人年龄、性别、分化 程度和淋巴结转移无相关性，但与肿瘤浸润深度和肿瘤部位相关(尸均0．05)。⑨与 表达水平显著高于对照组(尸O．05)，而siRNA．LMPl组与对照组比较无显著性差异。 MMP9．Survivin．CDK4和EGFRmRNA的转录表达无明显影响。 结论①EBV阴性细胞系中WNT5A的表达较为普遍，而在EBV阳性细胞系 中则表达缺失或下调，去甲基化试剂处理可诱使EBV阳性细胞系WNT5A的重新 或下调的重要机制。②EBVaGC组织中WNT5A编码基因启动子区呈高甲基化状态， 变化，这些变化可以抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，提示WNT5A在EBVaGC发 生发展中发挥负性调节作用。④胃癌组织细胞中Rb基因异常甲基化较为常见，EBV 可Rb基因甲基化，进而影响其基因表达参与EBVaGC的发生；而胃癌组织中EBV 感染对TGF．B1编码基因的甲基化以及蛋白表达无明显影响。⑤Rb异常甲基化、 表达缺失及TGF．D1表达检测可以作为临床判断胃癌浸润和转移的重要参考指标。 控ICAM．1和EGFR的表达。 博士研究生：刘霞 指导教师： 罗兵教授 关键词：EB病毒相关胃癌：甲基化：WNT5A：视网膜母细胞瘤： 转化生长因子p1 The mechanismoftumor-relatedin epigeneticregulation genes