5-Fu对NK2D配体MICAB蛋白表达的调节作用.pdfVIP

5．Fu对NKG2D配体MIcA侣蛋白表达的调节作用 摘要 5．Fu对NKG2D配体MICA／B蛋白表达的调节作用 摘要 综合治疗是恶性肿瘤的重要治疗原则，除传统的化疗、放疗及手术等治疗 方法外，免疫治疗的地位日益增强。自20世纪80年代末，Rosenberg等发现 hokiIleactiVated 淋巴因子激活的自体杀伤细胞(1ymp killef，LAK)经大剂量几．2 体外扩增后，可治疗恶性肿瘤，由此提出了过继性免疫细胞治疗肿瘤的概念。NK 细胞因不需活化即具有细胞毒作用，且抗瘤谱较广而被广泛研究，然而由于NK 细胞的杀伤活性与几-2的剂量高低、体内活化NK的数量及肿瘤表面ⅫC．I 类抗原的表达高低有关，致使NK细胞在临床应用中的疗效不一。因而临床上一 般用NK细胞免疫治疗联合化疗来达到治疗肿瘤更好的效果。研究表明，NK细 胞表面有抑制性受体及活化性受体，通过调节其受体的表达可影响NK细胞的杀 伤活性。NKG2D是NK细胞表面非常重要的活化性受体，NKG2D及其配体介 导的杀伤活性对NK细胞的杀伤起着非常重要的作用。 NKG2D配体为“诱导性”表面抗原，许多因素可以调控它的表达，如电离辐 射、热休克、病毒感染等可使肿瘤细胞表面NKG2D的配体表达升高，增加NK 细胞的活化信号，从而增强肿瘤细胞对NK细胞的敏感性。2009年Nice等发现 了一个新的NKG2D配体表达调控机制一翻译后调控。他的研究结果表明小鼠的 NKG2D配体Multl具有较长的胞内段并含有6个赖氨酸，其在细胞表面的表达 受泛素化和溶酶体降解的调控。当靶细胞受到紫外线照射后Multl的泛素化水平 降低，溶酶体降解减少，导致靶细胞表面Munl表达的增加。并推测细胞表面跨 膜蛋白M【CA，MIcB和鼬址T．1G在胞质尾存在赖氨酸残基一泛素化位点，很 可能也存在着泛素化调控机制。 因此本课题以人类宫颈癌细胞系HeLa为模型，研究抗肿瘤药5-Fu对HeLa 的影响，并探讨MICA胞内段对MICA在HeLa细胞表面表达的影响，为临床肿 瘤化疗联合NK细胞治疗肿瘤提供实验依据。 NK92细胞杀伤敏感性的影响。2．~ⅡCA全长及胞内段缺失突变体的克隆和表达 载体的构建。3．5．Fu及蛋白酶体抑制剂MGl32对表达MICA全长及胞内段缺失 突变体的HeLa细胞表面NKG2D配体MICA表达的影响。 研究方法：不同浓度的5．Fu处理HeLa细胞，在不同时间点用半定量PCR及 5-Fu对NKG2D配体hⅡCA／B蛋白表达的调节作用 摘要 MICB，用MTT法检测封闭前后HeLa细胞对NK92细胞杀伤的敏感性的变化。 分别扩增MICA全长及MICA截短体基因，将其插入真核表达载体 时，用流式细胞术检测细胞表面MICA的表达变化。 5-Fu的作用 的表达随5-Fu作用浓度增加(2．5至40pg／m1)逐渐增高。40熠-／ⅡIl 效果随着作用时间的延长(O至24h)而增加。荧光定量PCR结果显示5-Fu可 检测结果表明细胞表面的MICA表达增加，MICB不变，而且MlCA的增加主 要依赖于未凋亡细胞的表达。杀伤实验结果显示5．Fu可增加NK92细胞对HeLa 细胞的杀伤率，杀伤作用可部分被NKG2D抗体、MICA抗体抑制，MICB抗体 没有抑制作用。构建了含有MICA全长和MICA胞内段缺失突变体的真核表达 细胞，并用5-Fu和蛋白酶体抑制剂MGl32处理细胞，流式结果显示转染MICA 细胞表面MICA表达不变，而转染MICA全长，5．Fu作用后M【CA表达变化趋 势相反。 达没有明显变化，MIC～B在细胞表面表达的差异可能与是否含有泛素化位点的 胞内段有关。提示化疗联合NK细胞免疫治疗宫颈癌可能产生协同作用，提高 治疗效果，胞内段存在与否对MICA在HeLa细胞表面表达有影响，具体机制还 需进一