ABCA1胞外四环缺失突变体的构建及其抗砷性研究.pdfVIP

ABCA1 胞外第四环缺失突变体的构建及其抗砷性研究 摘 要 目的：构建ABCA1 蛋白胞外第四环第1479～1597 位氨基酸残基缺失的突变体。转染HeLa 细胞后 观察其抗砷性变化，推测此突变体可能发挥的功能。 方法：采用重叠区扩增基因拼接法构建 ABCA1 第 1479～1597 位氨基酸残基缺失的突变体基因， 并将其克隆至pcDNA3.1/V5-His/ABCA1 载体上，脂质体法转染HeLa 细胞，激光共聚焦观察突变体 蛋白定位，Cell Counting Kit-8 （CCK-8 ）试剂盒检测其48h 急性砷中毒后生存率的变化，流式细胞 术检测细胞凋亡率的改变，原子荧光吸收光谱法检测细胞内的总砷含量。 结果：该突变体基因经DNA 序列分析表明：具有正确的序列和阅读框。激光共聚焦证实其表达的 蛋白仍然能正确定位在HeLa 细胞的细胞膜上。CCK-8 结果显示转染wild-type ABCA1(WT)质粒和 ABCA1 △1479～1597AA(ABCA1△)质粒的细胞在各种砷浓度下生存率都较空载体对照组(control) 高。随机区组设计的方差分析比较各浓度下三组之间生存率的差异，WT 、ABCA1△与对照组的 P 值均小于0.01 ,证明WT 、ABCA1△与对照组的生存率差异均有统计学意义（WT 与ABCA1△生存 率无差异）。WT 以及ABCA1△的半数抑制浓度IC50 分别为31.333 μmol/ L 、28.631 μmol/ L ，均高 于对照组半数抑制浓度17.710 μmol/ L 。流式细胞术结果显示，转染WT 质粒和ABCA1△质粒的细 胞在30 μmol/l 的砷浓度下细胞凋亡率都较对照组低。原子荧光分光光度法结果显示，ABCA1 蛋白 高表达后，WT 组和ABCA1△组HeLa 细胞内砷含量在各时间段均低于对照组细胞，且4h 后细胞内 砷蓄积量趋于稳定，而对照组细胞内砷蓄积量持续增加。 结论：成功构建了ABCA1 细胞外第四环第 1479～1597 位氨基酸残基缺失的突变体，且其表达的 蛋白仍然正确定位于HeLa 细胞的细胞膜上，突变体ABCA1△1479～1597 仍然具有一定的抗砷性， 且与wild-type ABCA1 无明著差别，提示ABCA1 胞外第四环可能不是关键抗砷结构域。 关键词：ABCA1, 突变体, 重叠区扩增基因拼接法, 激光共聚焦, CCK8, 抗砷基因 研究类型：A(基础研究) 国家自然科学基金资助项目 I ABCA1 胞外第四环缺失突变体的构建及其抗砷性研究 Abstract Objective: To construct a ABCA1 mutant with the 1479th to 1597th amino acid codons deleted ，and presume its possible function involved in arsenic-resistance transfected into HeLa cell by lipofection. Methods: This mutant gene was amplified by gene splicing by overlap extension, then inserted into pcDNA3.1/V5-His/ABCA1 vector and transfected into HeLa cell by lipofection. The location and arsenic-resistant ability of the mutant were investigated by confocal microscopy ,CCK-8 assay, flow cytometry and atomic fluorescence spectrophotometry. Results: Sequence analysis s