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amiRNA介抗性转基因烟草植株的抗病性分析.pdf
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目 录
1．3．4
siRNA策略在植物抗病毒中的应用……………………………………8
1．4
miRNA的产生及其作用机制……………………………………………9
1．4．1
miRNA的功能…………………………………………………………11
1．4．2
amiRNA策略及其应用………………………………………………．11
1．4．3
amiRNA策略在植物抗病毒方面的研究进展………………………．12
1．5本课题的研究目的及意义………………………………………………12
2材料与方法…………………………………………………………………………．．14
2．1实验材料…………………………………………………………………14
2．1．1植物材料………………………………………………………………．14
2．1．2植物材料培养…………………………………………………………14
2．1．3菌株、质粒与毒源……………………………………………………。14
2．1．4酶与各种生化试剂……………………………………………………14
2．1．5
PCR引物……………………………………………………………………………………15
8
2．2实验方法…………………………………………………………………1
2．2．1拟南芥总DNA的提取………………………………………………．18
2．2．2
pre．miRNA的扩增……………………………………………………．18
2．2．3amiRNA的筛选…………………………………………………………20
2．2．4
pre．miRNA的改造……………………………………………………．21
2．2．5植物表达载体的构建…………………………………………………25
2．2．6农杆菌介导转化烟草…………………………………………………28
2．2．7转基因植株的PCR鉴定……………………………………………。29
2．2．8转基因植株中靶基因剪切位点的验证………………………………34
2．2．9
PCR目的片段的回收…………………………………………………．．34
2．2．10目的片段与克隆载体连接…………………………………………。34
2．2．1
1大肠杆菌感受态细胞制备…………………………………………．．35
2．2．12大肠杆菌感受态细胞的转化………………………………………．．35
2．2．13大肠杆菌感受态细胞的转化…………………………………………35
2．2．14重组质粒的酶切鉴定………………………………………………．．38
2．2．15农杆菌感受态的制备…………………………………………………39
2．2．16植物总RNA的提取…………………………………………………39
2．2．17植物小RNA的提取…………………………………………………41
2．2．18探针的制备…………………………………………………………．．42
2．2．19杂交………………………………………………………………………………．43
2．2．20荧光定量PCR………………………………………………………．44
2．2．21
5RLM-RACE……………………………………………………………………………44
3结果与分析………………………．．．……………………………………………………47
3．1拟南芥pre．miRNA的扩增……………………………………………．．47
II
3．7．2
Tl代转基因植株对FX21．PVX的抗病性分析………………………68
3．7．3转基因植株广谱抗性的鉴定…………………………………………74
3．8双抗转基因植株的获得…………………………………………………77
3．8．1双抗表达载体的构建以及再生植株的获得…………………………77
3．8．2双抗转基因植株的抗病性分析……………
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