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6种水产养殖鱼类常见弧菌抗原芯片检测技术的建立 摘要 近年来我国水产养殖业飞速发展，养殖的水产动物种类日益增多，随着集约 化养殖形式和养殖密度不断扩大，病原、宿主与环境之间的相互作用导致水产动 物的抵抗力降低，发病日趋频繁。细菌性疾病是水产动物最常见的一类疾病，是 目前水产养殖鱼类的主要病害，其中以弧菌病流行最为广泛。弧菌广泛分布于海 洋环境中，可以感染多种水产养殖鱼类并造成严重死亡，给水产养殖业造成巨大 的经济损失。 抗原芯片的基本原理是将抗原固定在芯片载体上制备成检测芯片，检测血清 中相对应的抗体，近些年己被广泛应用于临床学和流行病学。抗原芯片因其具有 高灵敏性、高特异性、高通量及多样品或多指标平行分析的优点，在病原检测方 面显示出广阔的应用前景。但目前将抗原芯片应用于水产动物细菌性疾病检测的 相关报道较少，因此本文将抗原芯片技术与水产动物免疫学原理相结合，选取鱼 肠道弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧茵、河流弧菌、哈维氏弧菌6种水产养 殖鱼类常见弧菌为研究对象，构建水产养殖鱼类常见弧菌的抗原芯片，并进行实 际应用，证明构建的抗原芯片可以应用于水产养殖鱼类6种常见弧菌性疾病的准 确诊断。具体结果如下： (，1)在确认各弧菌菌株致病性的基础上，提取各弧菌的外膜蛋白、胞外产物、 鞭毛蛋白等抗原组分以及全菌超声波破碎液，考马斯亮蓝法测定各抗原组分浓 度，以HI心标记牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体，进行了病原性确认。结果显示， 提取的各弧菌抗原组分均可与对应的牙鲆抗血清发生反应，说明其病原性良 好，可以用来构建抗原芯片。 (2)采用灭活全菌注射健康牙鲆，获取各弧菌的牙鲆抗血清；ELISA检测牙 鲆抗血清的效价变化并分析各抗原组分与牙鲆抗血清的交叉反应情况。结果显 示，牙鲆的抗体水平不断上升，在第4、5、6周达到最高，由此选取4—6周的 抗血清用于后续抗原芯片的检测。各弧菌的牙鲆抗血清均与对应弧菌的反应程 度最强烈，与其他种类的弧菌存在程度不等的交叉反应，而胞外产物和鞭毛蛋 白的交叉反应很小，确认了抗原芯片构建的可行性。 (3)采用前期优化的芯片载体、点样缓冲液、固定时间、封闭时间、抗体孵 育时间及清洗缓冲液；将网一弧菌的多种抗摄缝分点样予芯片载体组成一个矩 阵，构建6蕈孛弧菌抗原芯片，并对牙鲜抗盘滂进行检测。结果显示，矛鲆撬血清 与对瘦弧菌的备矩阵点全部显色，与其德弧嚣的矩阵赢秃显色菠瘦或部分显色， 说明构建熬抗原芯片可以用子水产养骧动物常见豹鑫种致瘸性弧麓熬准确捡 测。 ’ (_4)将制各的抗原芯片应用子人工感染矛鲆和盘然发病大菱鲆豹疾病检 测。结果显示，人工感染的牙解抗血清与抗原芯片上鳗弧菌的各抗原矩阵点反应 完全，羯然发瘸酶大菱鲆抗血清与抗原芯片上溶藻弧菌的备抗原矩阵点菠应完 全，说硬牙鲆为鳗弧萤感染，大菱鲆为溶藻弧菌感染。丽时采用E联S焱检测褥 到了耦霹的结粟。表鼹制备的弧蔷抗原芯冀可默应用予弧蔼病的实际捡测。 抗原芯片是一种重要的免疫芯片，是对传统免疫学检测手段酌发震。本文构 建熬抗原芯片霹以用子水产养殖惫类隧6种弧菌性疾病的有效检测，必水产养殖 动物弧菌瘸酌离通爨检测技术的发展提供了技术和实践基础。 荚键词：弧藿；抗愿芯片；E默SA；检测技术 6 Constructionof f．0rdetectionofstrains microarray antigen lninCUItUreQculturednshIISn 0tofVlbrl0vibriobacteriaDaCterla Abstract Wimthe of n砸ber CMIla，inCreaSing rapid