ELP-Intin介导的CA-MA抗菌肽的原核表达与纯化.pdfVIP

扬=!!：l盔堂亟±堂僮途塞 ! 纯化，Ul u 研究生：尹莉 导师：孙怀昌 摘 要 类弹性蛋I刍(Elastin-like 工合成蛋白分子，具有温度诱导的可逆相变特性，即随温度的改变从可溶(不溶) 剪切释放出来的一段氨基酸序列，其解离及两侧氨基酸序列的连接在自身催化作 达产物不仅可利用ELP的温度诱导可逆相变特性，用离心法进行纯化，而且可利用 Intein介导的表达系统 Intein自主剪切能力，使目的产物能自动释放。因此，ELP 不仅能解决表达产物的可溶性等问题，而且能大大简化分离纯化与裂解释放等难 题，对重组酶和抗菌肽的表达与纯化具有十分独特的优势。 抗菌肽(Antimicrobial 生物体内，具有广谱抗菌、抗病毒、抑制肿瘤等多种生物学活性和广泛的应用前 景。其中，CA—MA是由天蚕索A(CecropinA，CA)I～8个氨基酸与蛙皮素 II 活性，又具有抗肿瘤活性，而且不具有溶血性等细胞毒性，已在酵母和普通原核 系统获得成功表达，但其分离纯化过程复杂，生产成本较高。 为了构建简单、经济的抗菌肽表达系统，用限制酶消化法去除含ELP和AI．CM VMA 1为模板，)羽PCR扩增／出Seeintein编码序列，用其取 载体pET-EI；以pTYBl 其中的Mxe 呈麴!星L￡=!翌羔旦i凸企曼笪坠二丛蕴萱然盥厦毯塞姿皇纯丝 2 入适当的酶切位点，通过重叠PCR扩增出CA．MA编码序列，将其分别插入表达载 低温诱导表达，然后在不同温度下反复离心，获得融合蛋白前体 量为预期的3kDa：以DH5a大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，用琼脂扩散法 和微量肉汤稀释法进行溶菌活性和最小抑菌浓度检测，结果显示纯CA．MA具有抑 菌活性，最小抑菌浓度分别为14．5rtg／mL和9．2I-tg／mL。 关键字：ELP．Intein表达系统；CA．MA杂合肽；表达；纯化；抑菌试验 ELP·-Intein—-Mediatedand Expression PurificationofCA-—MA Peptide ABSTRACT Elastin—like aclassof polypeptides(ELPs)are havea reversibleinversetransition repeats，whichtemperature—induced areaclassof thatare outfromthe aminoacid segments peptide spliced precursor in all to maturationwith order sequencesprotein process autocleavageproperty．In antimicrobial different produce