E.coli L21(DE3)对乙酸或氨的耐受性及其重组蛋白表达碱性pH转换策略.pdfVIP

上海交通大学博士后出站报告 第1页 Ecoli BL21(DE3)对乙酸或氨的耐受性及其重组蛋白表达： 碱性pH转换策略 摘要 背景简介： 摇瓶培养与发酵罐培养的一个重要差别实际上体现在碳、氮源的供应和菌体产乙 酸程度上，这也是的放大过程经常出现问题的地方。乙酸和氨是大肠杆菌培养过程中 产生的两类可解离的小分子产物。许多报道认为乙酸积累通常会抑制菌体生长和外源 蛋白表达，这种问题在发酵罐上高密度培养菌体时最易出现。另有报道认为，发酵液 中较高浓度的铵离子对某些重组蛋白的表达有利。 理论基础： 乙酸和铵离子发挥作用同其未解离的分子即HAc分子和NH3分子的浓度紧密相 关。根据弱酸碱的电离平衡公式，我们知道，提高培养基的pH，可以减少发酵液中有 毒性的HAc分子浓度，和提高NH3分子的浓度。这两类未解离的中性分子可以以自 由扩散的方式跨过E．coli细胞膜，从而在胞内积累。调节培养基的pH可以调控胞内 的乙酸根和铵离子的浓度。 实验主要结果及其讨论： 该发酵策略主要是应用在E．coliBL21(DE)生产重组蛋白方面。是指在发酵过程 中，将摇瓶或发酵罐中培养基的pH控制在7．5．8．5之间，从而可以提高细胞对乙酸的 耐受性或者提高培养基中氨分子的浓度，来保证某些重组蛋白高水平地表达。 (1)在克服乙酸毒害： mM以内的乙酸钠所造成的培养基渗透压不会明显地抑制 我们的数据表明，300 coli EcoliBL21(DE3)的生长，有抑制作用的是HAc分子；300mM的乙酸钠对E BL21(DE3)表达重组蛋白的影响还依赖于具体的重组蛋白，有些蛋白的表达更易受到 乙酸的负影响，而pH的升高会增加这些重组蛋白的表达水平。另外，重组蛋白的表 达也会加重乙酸对菌体生长的抑制作用。 我们还发现50。300mM乙酸钠会严重地抑制菌体细胞膜还原性电子产生的强度。 mM 在各种所测试的pH条件下，300NaCl胁迫最高只能造成大肠杆菌细胞膜电子产 生活性10％的下降；而50．300mM的乙酸钠可以使该活性降低约50．75％，尤其是低 pH会加重这种副作用。这种乙酸钠的副作用可以通过提高培养基pH来缓解。 第1I页 上海交通大学博士后出站报告 乙酸抑制大肠杆菌的生长的机理主要有两种解释，一种即未解离形式的弱酸即 HAc分子是一种解偶联剂，可以自由扩散进细胞膜，从而造成跨膜ApH的崩溃；另一 种是胞内Ac一阴离子的高度积累所造成的后果。我们的数据显示，在实验室常见的大 coli 肠杆菌培养所用的pH条件和乙酸积累浓度下，E BL21(DE3)胞内乙酸的积累，并 不符合按照未解离的HAc分子自由扩散和平衡公式的计算得到的结果。 总之，在碱性pH环境下，可以使造成跨膜质子梯度崩溃的有害的HAc分子的浓 度和高度积累的胞内Ac-阴离子的浓度降低，提高大肠杆菌细胞膜电子产生活性，从 而在一定程度上减轻乙酸的副作用。碱性pH转换策略对于克1t7,酸副作用来讲，只 是一种补救策略，最有效的办法还是通过分子操作或过程控制来减少乙酸的产生。 (2)在增加培养基中氨分子浓度以促进重组蛋白表达： 本研究的结果表明，较高的pHEJ以提高培养基中氨分子浓度，从而可以在较低的胞 coli 却没有明显的促进作用。在碱性pH环境下，E BL21(DE3)胞内的铵离子浓度会有升 高，但远远低于根据铵离子电离平衡和自由扩散进出细胞膜所得到的理论值。 我们还发现250 mM浓度以上的(NH4)2S04会严重地抑制菌体细胞膜还原性电子 500 产生的强度。在pH6．5